Y染色体AZF区微缺失检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种检测Y染色体AZF区微缺失的检测试剂，包括引物组合物，针对Y染色体AZF区域和其他作为内部参考的特异性区域选定的引物位点设计了引物序列，这些引物序列的特点为：（1）每组引物均是以基因组上一段序列为模板来设计三条连续的引物，这三条引物连接后形成PCR模板；（2）在正常人染色体目标区域，引物位点序列存在已知且不变的拷贝数，且在目标区域之外的其他染色体区域不存在该序列；（3）这些序列引物具有接近的退火温度，波动范围<5℃；（4）与通用扩增引物序列不存在互补性；（5）内参位点仅在目标区域唯一出现，在基因组其他区域不存在该位点。还提供了检测Y染色体AZF区微缺失的试剂盒以及检测Y染色体AZF区微缺失的方法。

【技术实现步骤摘要】
Y染色体AZF区微缺失检测试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种采用gDNA或外周血游离DNA检测Y染色体AZF区微缺失的试剂盒及使用该试剂盒体外检测Y染色体AZF区微缺失的方法。
技术介绍
有研究报告指出，不育夫妇占已婚育龄夫妇的15％，其中男性因素约占一半，而男性不育症35％是由于遗传因素造成。Y染色体微缺失是除克式综合征外男性不育的最主要遗传因素。Y染色体大量的重复序列和回文结构在维持Y染色体进化稳定性的同时，也使Y染色体更容易发生结构重排，导致染色体部分缺失或重复。Y染色体微缺失主要发生在Y染色体上的AZF(azoospermiafactor)区。AZF区包括AZFa、AZFb、AZFc三个亚区，这些位置包括许多与精子形成有关的基因，这些区域的完全缺失或部分缺失可引起男性精子发生障碍、少精、弱精甚至无精症状。检测Y染色体AZF区微缺失现在已经成为男性不育专科的常规检查，可以为男性不育患者找出病因，为遗传咨询提供依据；也为临床医生的诊断与后续治疗提供指导。所以一种简单快速、准确度高且低成本的检测方法对临床具有重大意义。目前检测Y染色体AZF区微缺失的方法有很多，例如多重PCR、实时荧光PCR、芯片杂交、MLPA等技术，最常用的是使用多重PCR扩增序列标签位点(SequenceTaggedSite,STS)。该方法选择AZFa、AZFb、AZFc区的STS序列进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，根据条带的有无判断AZF各区是否发生缺失。欧洲男科协会(EuropeanAcademyofAndrology,EAA)和欧洲分子遗传质控网(EuropeanMolecularGeneticsQualityNetwork,EMQN)联合发布的《Y染色体微缺失分子诊断实践指南》推荐了多重PCR检测Y染色体AZF区微缺失的6个STS(AZFa：sY84，sY86；AZFb：sY127，sY134；AZFc：sY254，sY255)。在此基础上，各个检测实验室可选择性地增加STS的数量进行更精确的检测。这种方法简单易行，目前使用最广泛。但是这种方法扩增的STS位点较少(6个或以上)，而且电泳只能定性检测目的产物是否存在，不能检测拷贝数的变化，这对于Y染色体AZF区部分缺失的情况可能检测不精确，所以这种方法在检测准确度和灵敏度上还有待提高。其中一个方法是增加检测的STS数量，但这需要进行多次多重PCR反应，从而大大增加实验工作量和检测成本。检测Y染色体AZF区微缺失还可以使用多重实时荧光PCR，这种方法简便快速更准确，但是探针设计繁琐并且需要报告基团修饰，价格昂贵，不适合临床推广使用。有文献报导采用芯片杂交技术检测Y染色体AZF区微缺失，相比于多重PCR技术，可以极大地提高检测的准确度和灵敏度。但缺点是该方法需要设计大量的探针，成本较高，另外检测信号分析也较为复杂，不适合临床医生判读。MRC-Holland公司推出一款SALSAMLPAprobe-mixkitP360-A1试剂盒，用于Y染色体AZF区微缺失的检测，通过杂交、连接手段获取探针相对拷贝数信号，并根据产物长度识别对应探针，最终通过探针信号给出检测结论。该技术手段与芯片杂交技术一样，面临着检测信号分析复杂的缺陷，另外由于需要根据产物长度识别探针，在探针设计和识别上有着一定的局限性。综上所述，目前Y染色体AZF区微缺失的检测方法存在的缺陷主要有准确度和灵敏度低、成本高、检测结果判读复杂等。因此亟需开发一种Y染色体AZF区微缺失检测的新方法，来解决现有技术存在的上述不足。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种采用gDNA或外周血游离DNA检测Y染色体AZF区微缺失的引物系统、检测试剂、试剂盒和检测方法，以克服上述现有技术方法所存在的不足。本专利技术的第一方面提供了一种检测Y染色体AZF区微缺失的引物组合物，其引物位点包括至少6个Y染色体AZF区位点，以及至少一个Y染色体其他特异性区域的内参位点。其中，根据每个引物位点的序列设计上、中、下游三条引物，每条引物长10～50bp，优选为20bp；每个引物位点的所述上、中、下游三条引物在参考基因组序列上自5’到3’方向是连续的。所述参考基因组序列为hg18或hg19版本。优选地，所述引物的GC含量均为30％～70％，更优选50％。优选地，每个引物位点的所述中游和下游引物的5’端分别进行磷酸化修饰。优选地，每个引物位点的所述上游引物的5’端延伸15～30bp的保护序列，更优选为20bp。优选地，每个引物位点的所述上游引物的5’端和下游引物的3’端分别延伸通用扩增引物序列。本专利技术的引物系统的引物位点按照AZF区可划分到AZFa、AZFb及AZFc区的b1、b2、b3、b4、g1、g2、g3、r1、r2、r3、r4、y1、y2等不同的亚区(如图2所示)。其中b、g、r等亚区是本专利技术用来判定AZFc区详细缺失信息的重要参考区域。在一个特定的实施方案中，针对Y染色体AZF区域和其他作为内部参考的特异性区域(包括SRY基因、ZFY基因和TBL1Y基因等)选定的148个引物位点，共设计了148组引物序列。这些引物序列的特点为：(1)每组引物均是以基因组上一段序列为模板来设计三条连续的引物，这三条引物连接后形成PCR模板；(2)在正常人染色体目标区域，引物位点序列存在已知且不变的拷贝数，且在目标区域之外的其他染色体区域不存在该序列；(3)这些序列引物具有接近的退火温度，波动范围<5℃；(4)与通用扩增引物序列不存在互补性；(5)内参位点仅在目标区域唯一出现，在基因组其他区域不存在该位点。所述引物位点的上、中、下游三条引物的序列分别选自SEQIDNO:n、SEQIDNO:(n+148)、SEQIDNO:(n+296)，其中n为1～148的自然数。最优实施方式中，所述引物组合物包括序列分别为SEQIDNO:1-444的全部引物。本专利技术的第二方面提供了上述引物组合物组合物的用途。上述引物组合物可用于制备用于检测Y染色体AZF区微缺失的诊断试剂或试剂盒。上述引物组合物可用于体外检测Y染色体AZF区微缺失。所述检测可以是诊断目的(例如诊断男性不育等)，也可以是非诊断目的(例如实验室研究等)。本专利技术的第三部分提供了一种检测Y染色体AZF区微缺失的检测试剂，其包括上述引物组合物。本专利技术的第四部分提供了一种检测Y染色体AZF区微缺失的试剂盒，其包括上述引物组合物。优选地，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、通用PCR引物、DNA聚合酶、DNA连接酶、末端转移酶、dNTPs、反应缓冲液、用于纯化PCR反应产物的磁珠及缓冲液；更优选地，还包括阴性质控品和阳性质控品；最优选地，还包括用于高通量测序的试剂。所述的高通量测序方法选自IonTorrent的PGM、Proton或Illumina的Hiseq、Miseq。本专利技术的第五方面提供了一种体外检测Y染色体AZF区微缺失的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取gDNA或外周血游离DNA作为模板；(2)将本专利技术的引物组合物与DNA模板进行杂交反应；(3)杂交产物进行连接反应；(4)将连接产物进行纯化；(5)将纯化后的产物进行PCR扩增，构建文库；(6)将PCR扩增产物进行高通量测序；(7)测序数本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测Y染色体AZF区微缺失的检测试剂，包括引物组合物，其特征在于，引物位点包括至少6个Y染色体AZF区位点，以及至少一个Y染色体其他特异性区域的内参位点。

【技术特征摘要】
1.一种检测Y染色体AZF区微缺失的检测试剂，包括引物组合物，其特征在于，引物位点包括至少6个Y染色体AZF区位点，以及至少一个Y染色体其他特异性区域的内参位点；所述的AZF区引物位点覆盖AZFa区，以及AZFbc区的y、b、g、r、t、grey亚区；其中，根据每个引物位点的序列设计上、中、下游三条引物，每个引物位点的所述上、中、下游三条引物在参考基因组序列上自5’到3’方向是连续的；所述引物组合物包括序列分别为SEQIDNO:1-444的全部引物。2.权利要求1的检测试剂，所述引物组合物由序列分别为SEQIDNO:1-444的引物组成。3.权利要求1的检测试剂，每个引物位点的所述上游引物的5’端延伸15~30bp的保护序列，每个引物位点的所述上游引物的5’端和所述下游引物的3’端分别延伸通用扩增引物序列。4.权利要求2的检测试剂，每个引物位点的所述上游引物的5’端延伸15~30bp的保护序列，每个引物位点的所述上游引物的5’端和所述下游引物的3’端分别延伸通用扩增引物序列。5.一种检测Y染色体AZF区微缺失的试剂盒，包括引物组合物，其特征在于，引物位点包括至少6个Y染色体AZF区位点，以及至少一个Y染色体其他特异性区域的内参位点；所述的AZF区引物位点覆盖AZFa区，以及AZFbc区的y、b、g、r、t、grey亚区；其中，根据每个引物位点的序列设计上、中、下游三条引物，每个引物位点的所述上、中、下游三条引物在参考基因组序列上自5’到3’方向是连续的；所述引物组合物包括序列分别为SEQIDNO:1-444的全部引物。6.权利要求5的试剂盒，所述引物组合物由序列分别为SEQIDNO:1-444的引物组成。7.权利要求5的试剂盒，每个引物位点的所述上游引物的5’端延伸15~30bp的保护序列，每个引物位点的所述上游引物的5’端和所述下游引物的3’端分别延伸通用扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯涛，李崎，马燕琳，李玉帅，刘沙沙，沈珺瑶，
申请(专利权)人：北京嘉宝仁和医疗科技有限公司，海南医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：北京;11