靶向免疫治疗胰腺癌的载药纳米微粒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于治疗胰腺癌的靶向载体，其包括：用于靶向识别胰腺癌细胞的CD44v6单链抗体、以及纳米载体IONP-PEI；其中CD44v6单链抗体与纳米载体IONP-PEI偶联。另一方面，本发明专利技术提供了一种用于治疗胰腺癌的纳米微粒，其包括前述靶向载体、沉默RNA、以及吉西他滨化疗药物，其中，沉默RNA和吉西他滨复合于前述靶向载体上。本发明专利技术构建了高效、安全、具有靶向功能的非病毒基因载体。将沉默RNA和吉西他滨通过纳米载体偶联，并且与抗CD44v6单链抗体偶联，将基因治疗、化疗和生物靶向治疗联合应用，为抗胰腺癌新型药物研发提供了新思路和科学依据。

【技术实现步骤摘要】
靶向免疫治疗胰腺癌的载药纳米微粒及其应用
本专利技术涉及用于治疗胰腺癌的靶向载体、纳米微粒及其应用
技术介绍
胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，具有发病隐匿、易转移、长期生存率低的特点。根治性手术切除是治疗胰腺癌的首选方法，但大多数胰腺癌患者确诊时已属晚期，手术切除率<20％，化疗是主要治疗手段，但由于肿瘤化疗耐药的存在，化疗药物效果不甚理想，开发新的药物以更有效地治疗胰腺癌是临床迫切需要解决的问题。自1997年起，吉西他滨是临床抗胰腺癌治疗的一线药物，但在远期疗效和预后方面并未取得突破性进展，其原因可能与肿瘤细胞对吉西他滨耐药有关。B淋巴瘤莫洛尼鼠白血病病毒插入区1(BlymphomaMoloneymurineleukemiavirusinsertionregion1，Bmi-1)蛋白在人类多种恶性肿瘤中高表达，如头颈部肿瘤、乳腺癌、胰腺癌，其表达与肿瘤的发生发展有关。Bmi-1参与细胞周期、干细胞增殖、分化与衰老的调控，也可以诱导细胞的早期转化。研究表明抑制Bmi-1的表达可以抑制胰腺癌细胞的增殖，甚至可以逆转胰腺癌细胞的恶性特性、增加胰腺癌细胞的药物敏感性。siRNAs(smallinterferenceRNA)诱导的RNA干扰是特异性沉默靶基因的有利工具，但是缺乏有效载体限制了其体内应用。目前聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)是最为广泛应用的纳米载体，其具有阳性电荷，能与带阴性电荷的细胞膜结合，获得较高的转染率，从而将siRNA带入细胞内发挥作用。将吉西他滨和生物靶向药物联合应用来提高疗效和降低反应毒性是近年来研究最为活跃的领域之一。联合使用siRNAs和化疗药物，将化疗和基因治疗联合应用得到更强大、更持久的协同抗肿瘤作用。利用纳米材料将化疗药物包封，和包载siRNAs的纳米载体同时输送至胞内，可减低药物的急性毒性并提高疗效。另外，纳米载体还可以偶联抗体，利用抗体靶向识别抗原的特性，将包载的基因或药物靶向输送到肿瘤细胞，在增强抗瘤效应的同时减低对正常组织细胞的非特异毒性。IONP(magneticironoxidenanoparticles)是一种能向细胞输送药物且具有磁共振(magneticresonanceimaging，MRI)成像功能的载体。胰腺癌细胞高表达抗粘附因子CD44v6，可作为识别胰腺癌的标靶。抗CD44v6单链抗体(theanti-CD44v6singlechainvariablefragment，scFvCD44v6)具有高度亲和力和靶向性，能够靶向地识别胰腺癌细胞。专利技术人前期研究表明，载药(基因)纳米微粒与单链抗体进行交联制成免疫纳米微粒，可提高药物对肿瘤细胞的选择性，达到提高疗效、降低毒副作用的目的。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于治疗胰腺癌的靶向载体，其包括：用于靶向识别胰腺癌细胞的CD44v6单链抗体、以及纳米载体IONP-PEI；其中CD44v6单链抗体与纳米载体IONP-PEI偶联。CD44v6单链抗体与纳米载体IONP-PEI偶联后在体内外均能够靶向地识别胰腺癌细胞。另一方面，本专利技术提供了一种用于治疗胰腺癌的纳米微粒，其包括前述靶向载体、以及沉默RNA，其中，沉默RNA搭载于前述靶向载体上。具体而言，沉默RNA为Bmi-1基因的沉默RNAs，即siBmi-1。该搭载了siBmi-1的纳米微粒可沉默胰腺癌细胞Bmi-1基因表达，引起Panc-1细胞克隆形成能力减弱、细胞周期阻滞、增殖受抑、迁移和侵袭减少。进一步地，纳米微粒包括吉西他滨化疗药物(以下简称吉西他滨)，吉西他滨与siBmi-1共载(复合)于胰腺癌靶向载体上。该共载了吉西他滨和siBmi-1的纳米微粒可有效地沉默Bmi-1基因表达，诱导细胞凋亡，在抑瘤方面具有协同效应。本专利技术构建了高效、安全、具有靶向功能的非病毒基因载体。将siRNAs和吉西他滨通过纳米载体偶联，并且与抗CD44v6单链抗体偶联，将基因治疗、化疗和生物靶向治疗联合应用，为抗胰腺癌新型药物研发提供了新思路和科学依据。附图说明图1为实施例1中，N/P比值为20时IONP-PEI(非靶向组)和scFv-IONP-PEI(靶向组)转染Panc-1细胞后荧光显微镜下观察；图2为实施例1中，scFv-IP/siRNAs纳米微粒的细胞内吞及在细胞内的分布，FITC-标记的小鼠抗人6×Histag抗体特异性与scFvCD44v6结合，因此内吞scFv-IP/siRNAs的Panc-1细胞在荧光显微镜下呈绿色荧光；图3为实施例1中，N/P比值为20时IONP-PEI(非靶向组)和scFv-IONP-PEI(靶向组)的转染率，(*vslipo,#vsscFv-IONP-PEI,P<0.05)；图4为实施例1中，IP/siBmi-1及scFv-IP/siBmi-1转染Panc-1细胞后对细胞增殖的影响；图5为实施例1中，IP/siBmi-1及scFv-IP/siBmi-1转染Panc-1细胞后对细胞克隆形成能力的影响；图6为实施例1中，IP/siBmi-1及scFv-IP/siBmi-1转染Panc-1细胞后对细胞迁移、侵袭能力的影响；图7为实施例1中的活体荧光呈像：IP/siRNAs和scFv-IP/siRNAs在体内不同时间段的分布(小鼠尾静脉注射IP/siRNAs和scFv-IP/siRNAs后不同时间点荧光物质在体内的分布)；图8为实施例1中的离体荧光呈像：小鼠尾静脉分别注射IP/siRNAs和scFv-IP/siRNAs后，48小时后将小鼠安乐死，取出各组织器官进行离体组织呈像；图9为实施例2中，scFv-Gem-IONP复合物的透射电镜图；图10为实施例2中，scFv-Gem-IONP复合物中吉西他滨释放曲线；图11为实施例2中，Panc-1细胞经过不同处理组后细胞毒性(Gem，Gem-IONP，scFv-Gem-IONP，scFv-Gem-IONP/siBmi-1在不同浓度作用于Panc-1细胞后对细胞的杀伤作用)；图12为实施例2中，不同处理组裸鼠移植瘤组织学检查，小鼠尾静脉注射PBS(control)、IP-SCR、IP-siBmi-1及scFv-IP-siBmi-1后，实验终点将各组移植瘤组织进行Bmi-1染色检测各组织Bmi-1蛋白表达情况检测各组体内沉默Bmi-1表达情况；图13为实施例2中，不同处理组裸鼠移植瘤组织学检查，小鼠尾静脉注射PBS(control)、Gem、Gem-IONP、scFv-Gem-IONP、scFv-Gem-IONP/siBmi-1，实验终点将各组移植瘤组织进行Bmi-1、Bcl-2、Bax染色检测各组Bmi-1基因沉默效果及凋亡相关蛋白表达。具体实施方式实施例1本实施例的靶向载体包括CD44v6单链抗体、以及纳米载体IONP-PEI，其搭载了siBmi-1。本实施例的内容包括实验方法和结论分析两部分。一、实验方法1、细胞培养人胰腺癌细胞株Panc-1在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，恒温37℃，5％CO2培养箱中培养。2、靶向载体构建scFvCD44v6(CD44v6单链抗体)按照中国专利2011102402903、201110240287本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于治疗胰腺癌的靶向载体，其包括：用于靶向识别胰腺癌细胞的CD44v6单链抗体；以及纳米载体IONP‑PEI；其中所述CD44v6单链抗体与所述纳米载体IONP‑PEI偶联。

【技术特征摘要】
1.一种用于治疗胰腺癌的纳米微粒，其包括靶向载体、以及沉默RNA，其中，所述沉默RNA搭载于所述靶向载体上；所述靶向载体包括用于靶向识别胰腺癌细胞的CD44v6单链抗体、以及纳米载体IONP-PEI，其中所述CD44v...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈茵婷，黄开红，曾林涓，李佳佳，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，陈茵婷，黄开红，曾林涓，李佳佳，
类型：发明
国别省市：广东;44