表达嵌合的主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的转基因小鼠制造技术

本发明专利技术涉及基因修饰的非人动物，其表达嵌合人/非人MHC I多肽以及人或人源化β2微球蛋白多肽，以及包括上述相同多肽的胚胎、细胞以及组织。还涉及用于制备所述基因修饰动物的构建体和制备方法。还涉及使用所述基因修饰动物用以研究人类免疫系统多个方面的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表达嵌合的主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的转基因小鼠交叉引用相关申请本申请要求2013年3月11日提交的美国申请号13/793,812的权益，其内容在此全部并入本申请。专利
本专利技术涉及一种基因修饰的非人动物，如啮齿动物(如小鼠或大鼠)，其表达一种人或人源化的主要组织相容性复合物(MHC)I类分子。本专利技术还涉及一种基因修饰的非人动物，如小鼠或大鼠，其表达一种人或人源化的MHCI蛋白(如MHCIα链)和/或人或人源化β2微球蛋白；以及表达其的胚胎、组织和细胞。本专利技术还提供了制备表达人或人源化MHCI类蛋白(如MHCIα链)和/或β2微球蛋白的基因修饰非人动物的方法。本专利技术还提供了在体外人源化细胞免疫系统或在基因修饰非人动物中的背景下鉴定和评估肽的方法，以及修饰非人类动物如小鼠或大鼠的MHCI和/或β2微球蛋白基因座，以表达人或人源化MHCI和/或β2微球蛋白。技术背景在适应性免疫应答中，外来抗原被B淋巴细胞和T淋巴细胞上的受体分子(如免疫球蛋白和T细胞受体或TCR)识别。这些外来抗原作为肽片段由专门蛋白在细胞表面呈递，统称为主要组织相容性复合物(MHC)分子。MHC分子由多个基因座编码，这些基因座作为基因的连接簇跨度约4Mb。在小鼠中，MHC基因在17号染色体上，由于历史原因被称为组织相容性2(H-2)基因。在人类中，该基因在6号染色体上，并且被称为人类白细胞抗原(HLA)基因。小鼠和人类的基因座为多基因的；它们包括三个MHC基因高度多态类别(I类、II类和III类)，在人类和小鼠基因组中表现出类似结构(分别参见图2和图3)。MHC基因座在基因组中表现出最高的多态性；一些基因由>300个等位基因表示(如人HLA-DRβ和人HLA-B)。所有I类和II类MHC基因可以呈递肽片段，但每个基因表达具有不同结合特性的蛋白质，反映了多态性和等位基因变体。任何给定的个体具有可以在免疫应答过程中被B和T细胞呈递在细胞表面上的肽片段的独特范围。人类和小鼠均具有I类MHC基因(见图2和图3)。在人类中，经典I类基因被称为HLA-A、HLA-B和HLA-C，而在小鼠中它们是H-2K、H-2D和H-2L。I类分子由两条链组成：一条多态α链(有时被称为重链)和一条较小的链称为β2微球蛋白(也称为轻链)，其通常非多态(图1)。这两条链在细胞表面上形成非共价异源二聚体。该α链包括三个结构域(α1、α2和α3)。所述α链基因外显子1编码先导序列，外显子2和3编码的α1和α2结构域，外显子4编码α3结构域，外显子5编码跨膜域，以及外显子6和7编码胞浆尾。所述α链形成包括α1和α2结构域(类似Ig样结构域)及其后的α3结构域(其类似于β2微球蛋白)的肽结合裂隙。β2微球蛋白是一种12kDa的非糖基化蛋白；其功能之一是稳定MHCI类α链。不同于α链，β2微球蛋白不跨膜。人类β2微球蛋白基因座位于15号染色体上，而小鼠基因座位于2号染色体上。β2微球蛋白基因由4个外显子和3个内含子组成。β2微球蛋白的循环形式存在于血清、尿液和其他体液中；因而，该非共价MHCI相关的β2微球蛋白可以与生理条件下的循环β2微球蛋白进行交换。I类MHC分子在所有有核细胞中表达，包括肿瘤细胞。它们在T和B淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞，以及其他细胞中特异性表达，并将肽片段(长度通常为8-10个氨基酸)展示在CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表面。CTL专门杀死通过自身膜结合TCR识别的MHC-I结合肽的任意细胞。当一个细胞展示来源于细胞蛋白中通常不呈递的肽(如病毒、肿瘤或其他非自体来源)时(CTL识别这类肽)，CTL被激活并杀死展示所述肽的细胞。通常情况下，由于耐受机制，在MHCI类分子的背景下呈递正常(即自体)蛋白不引发CTL的激活。然而，在一些疾病(如癌症、自身免疫性疾病)中来源于自体蛋白的肽成为免疫系统细胞成分的靶标，这导致呈递这类肽的细胞受到破坏。虽然在识别某些引发细胞免疫反应的自体来源的抗原(如各种癌症相关的抗原)方面有一些进展，但为了提高对由人类CTL通过MHCI类分子识别肽的鉴别，依然需要从体内和体外系统模拟人体细胞免疫系统各方面。模拟人体细胞免疫系统的系统可以用于鉴别疾病相关抗原以开发人类治疗，如疫苗和其它生物制剂。用于在人免疫系统背景下评估抗原识别的系统可以协助鉴别治疗上有用的CTL群体(如在研究和对抗人类疾病中有用)。这类系统也可协助增强人类CTL群体活性以更有效地对抗传染病和携带外来抗原的实体。因此，需要生物系统(如基因工程动物)，这类系统可以生成一种展示模拟人体免疫系统功能的元件的免疫系统。专利技术概述本申请提供了一种生物系统，用于生成或鉴定与人类MHCI类蛋白及其嵌合物相关，以及与CD8+T细胞结合的肽。本申请提供了非人类动物，包括非人类细胞，其表达在细胞免疫反应中起作用的人类或人源化分子。本申请还提供了人源化啮齿动物基因座，其编码人类或人源化的MHCI和β2微球蛋白。本申请还提供了人源化啮齿动物细胞，其表达人或人源化的MHC和β2微球蛋白分子。本申请提供了包括人源化啮齿类动物细胞的体内和体外系统，其中，所述啮齿动物细胞表达一种或多种人或人源化免疫系统分子。本专利技术提供了非人动物，如啮齿动物(如小鼠或大鼠)，在其基因组中包括编码嵌合人/非人(如人/啮齿动物，如人/小鼠或人/大鼠)MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人部分包括人MHCI多肽的胞外域。具体地，本申请提供了非人动物，其包括在内源性MHCI基因座上编码嵌合人/非人MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人类部分包括人MHCI多肽的胞外域，并且其中所述动物表达嵌合的人/非人MHCI多肽。一方面，所述动物不表达来自内源非人类MHCI基因座的内源非人MHCI多肽的胞外域(如功能性胞外域)。在本专利技术的一个方面，所述非人动物(如啮齿动物，如小鼠或大鼠)包括MHCI基因座的两个拷贝，该基因座包括编码嵌合人/非人(如人/啮齿动物，如人/小鼠或人/大鼠)MHCI多肽的核苷酸序列。在本专利技术的另一个方面，所述动物包括MHCI基因座的一个拷贝，所述基因座包括编码嵌合人/非人MHCI多肽的核苷酸序列。因此，所述动物可为纯合或杂合的MHCI基因座，该基因座包括编码嵌合人/非人MHCI多肽的核苷酸序列。在各种不同的实施例中，所述编码嵌合人/非人MHCI多肽的核苷酸序列包括于所述非人动物(如啮齿动物，如大鼠或小鼠)的种系中。在一个实施方式中，所述嵌合MHCI基因座包括于非人类动物的种系中。在一个方面，所述编码嵌合人/非人MHCI的核苷酸序列与内源性非人调控元件，如启动子、增强子、沉默子等，可操作地连接。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的人类部分包括人先导序列。在另一个实施方式中，所述嵌合多肽包括非人先导序列，如内源性非人先导序列。在另外的实施方式中，所述嵌合多肽的人类部分包括人类MHCI多肽的α1，α2和α3结构域。所述人MHCI多肽可以选自由HLA-A、HLA-B以及HLA-C组成的组。在一个实施方式中，所述人MHCI多肽是HLA-A多肽，如HLA-A2多肽，如HLA-A2.1多肽。在另一个实施方式中，所述人MHCI多肽是HLA-B多肽，如HLA-B2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小鼠，其在内源性H‑2D基因座包括编码嵌合人/小鼠MHC I多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽包括人HLA‑B27多肽的胞外域、小鼠H‑2D多肽的跨膜域和小鼠H‑2D多肽的胞浆域；并且其中所述小鼠表达所述嵌合多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.11 US 13/793,8121.一种制备基因修饰的小鼠的方法，包括修饰小鼠基因组以在内源性H-2D基因座包括编码嵌合人/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合人/小鼠MHCI多肽包括人HLA-B27多肽的α1、α2和α3结构域和小鼠H-2D多肽的跨膜域和胞浆域；并且其中所述小鼠表达所述嵌合人/小鼠MHCI多肽。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述小鼠不表达来自内源性H-2D基因座的小鼠H-2D多肽的功能性胞外域。3.权利要求1所述的方法，其中所述内源性H-2D基因座缺乏编码小鼠H-2D多肽的α1、α2和α3结构域的内源性核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸序列包括内源性小鼠H-2D先导核苷酸序列。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸序列可操作地与内源性小鼠调控元件连接。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸序列包括人HLA-B27的α1外显子、人HLA-B27的α1-α2内含子、人HLA-B27的α2外显子、人HLA-B27的α2-α3内含子以及人HLA-B27的α3外显子。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述小鼠进一步在内源性β2微球蛋白基因座包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列，并且其中所述小鼠表达所述人或人源化β2微球蛋白多肽。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述小鼠不表达来自内源性β2微球蛋白基因座的功能性内源性β2微球蛋白。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述编码所述人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列可操作地与内源性小鼠β2微球蛋白调控元件连接。10.根据权利要求7所述的方法，其中所述编码所述人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包括人β2微球蛋白基因的外显子2至外显子4所示的核苷酸序列。11.根据权利要求7所述的方法，其中所述编码所述人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包括人β2微球蛋白基因的外显子2、外显子3和外显子4所示的核苷酸序列。12.一种制备基因修饰的非人动物的方法，包括修饰非人动物基因组以在内源性MHCI基因座包括编码两种或更多种嵌合人/非人MHCI多肽的两个或更多个核苷酸序列，其中所述两种或更多种嵌合人/非人多肽的每种包括人MHCI多肽的α1、α2和α3结构域、非人MHCI多肽的跨膜域和胞浆域；并且其中所述动物表达所述两种或更多种嵌合人/非人MHCI多肽。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述动物是啮齿动物。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠，并且其中所述非人MHCI多肽是小鼠H-2D多肽、小鼠H-2K多肽或小鼠H-2L多肽。16.根据权利要求12所述的方法，其中所述动物在内源性非人MHCI基因座不表达功能性的内源性非人MHCI多肽的胞外域。17.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·麦克唐纳，A·J·莫菲，C·古雷尔，J·麦克沃克，V·沃罗宁那，F·哈里斯，S·史蒂文斯，Y·薛，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US