抗HPV L1 蛋白的广谱单克隆抗体或其抗原结合片段及它们的用途制造技术

本发明专利技术涉及可广谱结合人乳头瘤病毒(HPV)L1蛋白的单克隆抗体及其抗原结合片段，以及编码它们的序列，产生它们的细胞株，和应用它们进行诊断、预防或治疗的方法和用途。

【技术实现步骤摘要】
抗HPVL1蛋白的广谱单克隆抗体或其抗原结合片段及它们的用途本申请是申请日为2012年6月8日、专利技术名称为“抗HPVL1蛋白的广谱单克隆抗体或其抗原结合片段及它们的用途”、申请号为201210190399.5的申请的分案申请。
本专利技术涉及分子病毒学和免疫学领域。具体而言，本专利技术涉及可广谱结合人乳头瘤病毒(HPV)L1蛋白的单克隆抗体及其抗原结合片段，以及编码它们的序列，产生它们的细胞株，和应用它们进行诊断、预防或治疗的方法和用途。
技术介绍
人乳头瘤病毒(HPV)是一种无包膜病毒,它由病毒衣壳以及包裹在衣壳内的约8kbDNA构成。HPV的病毒衣壳是由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成的直径为50-55nm的正二十面体颗粒。目前已经发现了100多种型别的HPV，其中，根据其与肿瘤发生的关系可以分为两类：低危型HPV――包括HPV6和HPV11，其致癌风险低，主要引起尖锐湿疣；高危型HPV――包括HPV16、18、31、33、35、39、45、52、58、59等，其是导致包括女性宫颈癌在内的多种肿瘤疾病的主要原因(CliffordGM，SmithJS，PlummerM，eta1.BrJCancer，2003，88(1)：63-73)。现有的研究结果表明，可以通过预防HPV感染来预防宫颈癌等疾病的发生。HPV的疫苗研究发现，体外表达的HPVL1蛋白能自组装成病毒样颗粒(VLP)，其结构与天然HPV高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表位，可诱导高滴度的中和抗体。因此，现有的以及正在研发的HPV疫苗多以病毒样颗粒为主要疫苗成分。然而，研究发现，HPVVLP主要诱导针对同型HPV的中和抗体，产生针对同型HPV的保护性免疫，而仅在一些同源性高的型别之间存在交叉保护(GiroglouT,SappM,FliggeC,etal.Vaccine.2001；19(13-14):1783-93；OrozcoJJ,CarterJJ,KoutskyLA.JVirol[J].2005；79(15):9503-14；FleuryMJ，TouzeA，MaurelMC,etal.ProteinSci.2009.18(7):1425-1438)。在疫苗研究中，单克隆抗体是疫苗抗原质控的重要工具，抗体水平是评价疫苗效果的标准，而且，抗体及其表位(尤其是中和抗体对应的中和表位)以及相应的中和机制也是疫苗研发的重要指针。进一步，在应用研究中，中和抗体，特别是广谱中和抗体，在HPV的诊断，预防和治疗上也将具有特别的优势。然而，现有研究表明，HPVL1蛋白所诱导的抗体大多为型别特异性中和抗体，极少有跨型别的广谱中和抗体的报道。目前，已发现的跨型别的抗体仅有HPV16J4、HPV16I23和HPV33E12这3株交叉中和单抗，它们能对几个型别的HPV具有一定程度的交叉中和作用。但是，这三株单抗的中和滴度较低，比特异性的中和单抗(如：中和抗体V5，参见Wang等，JournalofGeneralirology，78：2209－2215(1997))小100倍以上，这大大限制了这些单抗的应用。因此，本领域仍然需要更多、更有效的广谱抗体，尤其是广谱中和抗体，以能够对生产的疫苗及疫苗的保护效果进行更好的评价，并应用于HPV的诊断、预防和治疗中。
技术实现思路
本专利技术提供了可广谱结合HPVL1蛋白的单克隆抗体及其抗原结合片段，以及编码它们的序列，产生它们的细胞株，和应用它们进行诊断、预防或治疗的方法和用途。在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供相关术语的定义和解释。如本文中所使用的，术语“HPVL1蛋白”是指，人乳头瘤病毒(HPV)的L1蛋白，其是本领域公知的(参见，例如NCBIGENBANK数据库序列号：DQ469930.1)。在本申请中，当提及HPV的L1蛋白或VLP时，其主要涉及选自以下11种型别的HPV的L1蛋白或VLP：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58和HPV59。然而，本领域技术人员理解，术语“HPVL1蛋白”还可以包括其他型别的HPV的L1蛋白。在本申请中，为了方便起见，当描述HPVL1蛋白的氨基酸序列时，除非上下文特别指出，否则，参照HPV16L1蛋白的氨基酸序列进行描述。例如，表述“HPVL1蛋白的第303-308位氨基酸残基”是指，HPV16L1蛋白的第303-308位氨基酸残基。然而，如本文中所使用的，术语“HPVL1蛋白”意欲包括所有型别的HPV(特别是上述11种型别)的L1蛋白。因此，表述“HPVL1蛋白的第303-308位氨基酸残基”不仅包括HPV16L1蛋白的第303-308位氨基酸残基，而且包括其他型别的HPVL1蛋白中的相应序列片段。如本文中所使用的，当提及HPV16L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQIDNO:59的氨基酸序列来进行描述。例如，表述“HPV16L1蛋白的第303-308位氨基酸残基”是指，SEQIDNO:59所示氨基酸序列的第303-308位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HPV16L1蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本专利技术中，术语“HPV16L1蛋白”应包括所有此类序列，包括例如SEQIDNO:59所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HPV16L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQIDNO:59的序列片段，还包括SEQIDNO:59的天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HPV16L1蛋白的第303-308位氨基酸残基”包括，SEQIDNO:59的第303-308位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本专利技术，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR本文档来自技高网...

【技术保护点】
能够特异性结合多个型别(例如至少4个型别)的HPV的L1蛋白和/或VLP的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体包括：包含氨基酸序列为SEQ ID NO:29‑31的CDR的VH，和包含氨基酸序列为SEQ ID NO:32‑34的CDR的VL。

【技术特征摘要】
1.能够特异性结合多个型别的HPV的L1蛋白和/或VLP的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:29-31的CDR的VH，和包含氨基酸序列为SEQIDNO:32-34的CDR的VL；所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链抗体和双抗体，并且所述抗原结合片段包含氨基酸序列为SEQIDNO:29-31的CDR，和氨基酸序列为SEQIDNO:32-34的CDR。2.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体包括：如SEQIDNO:10所示的VH和如SEQIDNO:12所示的VL。3.权利要求1或2的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体选自人源化抗体和嵌合抗体。4.权利要求1或2的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体能够特异性结合选自下列的一种或多种型别的HPV的L1蛋白和/或VLP：HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52和HPV58。5.权利要求1或2的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体是中和抗体，其能够中和HPV33和HPV58。6.权利要求1或2的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种。7.权利要求6的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述非-CDR区来自人抗体。8.权利要求1或2的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株12B9产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株12B9保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCNO：C201266。9.分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列和能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，其中所述抗体重链可变区包含：氨基酸序列为SEQIDNO:29-31的CDR；所述抗体轻链可变区包含：氨基酸序列为SEQIDNO:32-34的CDR。10.权利要求9的分离的核酸分子，其中，所述抗体重链可变区具有SEQIDNO:10所示的氨基酸序列。11.权利要求9的分离的核酸分子，其中，所述能够编码抗体重链可变区的核酸序列如SEQIDNO:9所示。12.权利要求9的分离的核酸分子，其中，所述抗体轻链可变区具有SEQIDNO:12所示的氨基酸序列。13.权利要求9的分离的核酸分子，其中，所述能够编码抗体轻链可变区的核酸序列如SEQIDNO:11所示。14.一种载体，其包含权利要求9-13任一项的分离的核酸分子。15.一种宿主细胞，其包含权利要求9-13任一项的分离的核酸分子，或权利要求14的载体。16.制备权利要求1-8任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：李少伟，肖洁琼，魏旻希，陆剑，俞海，张军，夏宁邵，
申请(专利权)人：厦门大学，厦门万泰沧海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35