一种培养基及其应用与角质形成细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养领域，尤其涉及一种培养基及其应用与角质形成细胞的培养方法。本发明专利技术将KGF、EGF、谷氨酰胺和NEAA复配添加入基础培养基，所获得的培养基能够选择性的使角质形成细胞得到增殖，能够作为角质形成细胞原代和传代培养的培养基。实验证明，采用本发明专利技术提供的酶解方法能够获得大量活力良好的单个细胞，采用本发明专利技术提供的培养基进行培养后，可获得角质形成细胞所得细胞数量大、活力高，细胞特性在传代过程中保持良好。另外，本发明专利技术采用无血清培养基作为基础培养基，在保证了细胞活力的前提下，避免了异源血清带来的风险。

【技术实现步骤摘要】
一种培养基及其应用与角质形成细胞的培养方法
本专利技术涉及细胞培养领域，尤其涉及一种培养基及其应用与角质形成细胞的培养方法。
技术介绍
角质形成细胞是表皮细胞的主要组成部分，是一种能合成角质蛋白的上皮细胞。在角质形成细胞向角质细胞演变过程中，一般可以分为四层，即基底层、棘层、颗粒层以及角质层。有人把前三层或前二层称为生发层或马尔匹基层。此外，在某些部位，特别在掌跖部位，角质层下方还可见到透明层。从分化机制来看，干细胞并不直接分化成终末分化细胞，而是先分化成定向祖细胞，定向祖细胞经过一定分裂次数后定向分化，进而分化成有丝分裂后细胞及终末分化细胞，实验研究获取的表皮角质形成细胞一般为定向祖细胞。角质形成细胞的体外培养可为皮肤毒理学、烧伤治疗学、美容学和皮肤病发病机制的研究提供新的途径。但是，皮肤角质形成细胞分离培养中存在细胞易分化、易受成纤维细胞污染、不易贴壁等问题。不仅如此，角质形成细胞繁殖力较低、生活力弱，对生长条件要求较高，传代次数非常有限，培养过程中易被混杂的成纤维细胞过度繁殖而掩盖。因此，建立一种体系稳定、适合于皮肤角质形成细胞细胞生长增殖的培养方法成为了当务之急。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种培养基及其应用与角质形成细胞的培养方法，本专利技术提供的培养基能够作为角质形成细胞原代和传代培养的培养基，其具有选择性培养的作用，能够保证角质形成细胞在传代过程中的不被污染，增加传代次数。以本专利技术提供的角质形成细胞培养方法培养细胞，所得细胞数量大，活力高。本专利技术提供的培养基包括基础培养基、KGF、EGF、谷氨酰胺和非必需氨基酸。在本专利技术的实施例中，KGF与EGF的质量比为(8～12)：(8～12)。在一些实施例中，KGF与EGF的质量比为10：10。在本专利技术的实施例中，其中各组分的浓度为：KGF8ng/mL～12ng/mL；EGF8ng/mL～12ng/mL；谷氨酰胺0.5×～3×；非必需氨基酸0.5×～3×。在本专利技术的实施例中，其中各组分的浓度为：KGF9ng/mL～11ng/mL；EGF9ng/mL～11ng/mL；谷氨酰胺0.5×～1.5×；非必需氨基酸0.5×～1.5×。在一些实施例中，其中各组分的浓度为：KGF10ng/mL；EGF10ng/mL；谷氨酰胺1×；非必需氨基酸1×。在本专利技术的实施例中，基础培养基为KC-FSM无血清培养基。角质细胞生长因子(KeratinocyeGrowthFactor，KGF)是成纤维细胞生长因子家族的成员，能偶特异性的促进上皮细胞的增殖、迁移和分化。表皮细胞生长因子(Epidermalgrowthfactor，EGF)能促进上皮细胞、成纤维细胞的增值；增强表皮细胞的活力；延缓表皮细胞的老化。高活性的EGF才能促进皮肤细胞的分裂和生长，此外它还能刺激细胞外一些大分子(如透明质酸和胶原白等)的合成与分泌。谷氨酰胺，学名2-氨基-4-氨甲酰基丁酸，英文Glutamine(Gln)。谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。谷氨酰胺可为自行配置也可为市场购得，本专利技术对此不做限定，其实施皆在本专利技术的保护范围之内。本专利技术采用的谷氨酰胺为购自sigma的100×谷氨酰胺。非必需氨基酸(non-essentialaminoacid，NEAA)，包含7种细胞培养所需非必需氨基酸，即天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸。非必需氨基酸的添加能够增加细胞的繁殖力，延长细胞的生存时间。NEAA可为自行配置也可为市场购得，本专利技术对此不做限定，其实施皆在本专利技术的保护范围之内。本专利技术采用的NEAA为购自sigma的100×NEAA。本专利技术将KGF、EGF、谷氨酰胺和NEAA复配添加入基础培养基，所获得的培养基能够选择性的使角质形成细胞得到增殖。实验证明，采用本专利技术提供的培养基用于培养角质形成细胞所得细胞数量大、活力高，细胞特性在传代过程中保持良好。另外，本专利技术采用无血清培养基作为基础培养基，在保证了细胞活力的前提下，避免了异源血清带来的风险。本专利技术提供的培养基在培养角质形成细胞中的应用。本专利技术还提供了角质形成细胞的分离方法，包括以下步骤：步骤1：皮肤经中性分散酶I酶解后，取表皮层；步骤2：将表皮层以VIII型胶原酶酶解后，以本专利技术提供的培养基培养，获得角质形成细胞。在本专利技术的实施例中，皮肤为包皮。在一些实施例中，皮肤为0岁～12岁儿童的包皮。在本专利技术的实施例中，皮肤经清洗、破碎后酶解。在一些实施例中，清洗采用含有双抗的D-PBS溶液。在一些实施例中，双抗为青霉素和链霉素，含有双抗的D-PBS溶液中青霉素的浓度为100U/mL，链霉素的浓度为100μg/mL。在本专利技术的实施例中，步骤1中酶解的温度为4℃，时间为8h～12h。在本专利技术的实施例中，中性分散酶I以D-PBS溶液配制，其中中性分散酶I的浓度为2U/mL～2.4U/mL。在一些实施例中，中性分散酶I以D-PBS溶液配制，其中中性分散酶I的浓度为2U/mL0。在本专利技术的实施例中，皮肤与中性分散酶I溶液的体积比为1:10。在本专利技术的实施例中，步骤2中所述酶解的温度为18℃～30℃，时间为30min。在本专利技术的实施例中，VIII型胶原酶以D-PBS溶液配制，其中VIII型胶原酶的质量分数为0.05％～0.1％。在一些实施例中，VIII型胶原酶以D-PBS溶液配制，其中VIII型胶原酶的质量分数为0.1％。在本专利技术的实施例中，表皮层与VIII型胶原酶溶液的体积比为1:10。在本专利技术的实施例中，以本专利技术提供的培养基培养细胞接种密度为2×105cell/mL。在本专利技术的实施例中，表皮层经VIII型胶原酶酶解后所获得的细胞为单个细胞，经本专利技术提供的培养基的选择培养后，细胞呈铺路石形态，为角质形成细胞特有形态，纯度良好。获得角质形成细胞。在本专利技术的实施例中，D-PBS为杜氏磷酸盐缓冲液，其中不含Ca2+或Mg2+；其中各组分的浓度为：KCl0.2mg/L；KH2PO40.2mg/L；NaCl8.0mg/LNa2HPO41.15mg/L；pH值为7.4。采用本专利技术提供的酶解方式对皮肤进行处理获取单个细胞，实验表明，以本专利技术提供的酶解方式处理2cm×2cm包皮，能够获得的总细胞数为1.53×106个，细胞活率为90.85％，说明本专利技术处理皮肤所获得的细胞数量大，细胞活力高。本专利技术还提供了角质形成细胞的培养方法，包括以下步骤：步骤1：皮肤经中性分散酶I酶解后，取表皮层；步骤2：将表皮层以VIII型胶原酶酶解后，以本专利技术提供的培养基培养后，以本专利技术提供的培养基传代。在本专利技术的实施例中，传代的次数为1次～8次。在一些实施例中，传代的次数为3次～5次。在本专利技术的实施例中，传代培养接种于本专利技术提供的培养基的细胞密度为1×105cell/mL。实验表明，将本专利技术细胞传代8次，仍能保持良好的角质形成细胞的形态，未发生污染。本专利技术提供了一种培养基及其应用与角质形成细胞的培养方法，本专利技术将KGF、EGF、谷氨酰胺和NEAA复配添加入基础培养基，所获得的培养基能够选择性的使角质形成细胞得到增殖，能够作为角质形成细胞原代和传代培养的培养基。实验证明，采用本专利技术提供的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养基，其特征在于，包括基础培养基、KGF、EGF、谷氨酰胺和非必需氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种角质形成细胞的培养基，其特征在于，由KC-FSM无血清培养基、KGF、EGF、谷氨酰胺和非必需氨基酸组成；其中各组分的浓度为：KGF8ng/mL～12ng/mL；EGF8ng/mL～12ng/mL；谷氨酰胺1×～3×；非必需氨基酸1×～3×。2.权利要求1所述的培养基在培养角质形成细胞中的应用。3.一种角质形成细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：皮肤经中性分散酶I酶解后，取表皮层；步骤2：将所述表皮层以VIII型胶原酶酶解后，以权利要求1所述的培养基培养，获得角质形...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，王一飞，葛啸虎，卢瑞珊，张维敏，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44