微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法技术

本发明专利技术涉及微生物能力验证技术领域，公开了一种微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，以沙门氏菌为目标菌，以粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，包括：(A)、菌株的复苏、增菌；(B)、菌株的分离；(C)、菌悬液的制备；(D)、冷冻干燥和包装。最后制备的样品包括：简单级阴性样品，简单级阳性样品；中级阴性样品，中级阳性样品；困难级阴性样品，困难级阳性样品。同一等级的样品配对使用。本发明专利技术方法制备的样品稳定性好，菌种存活率高，且具有合理的不同难度等级标准。

【技术实现步骤摘要】
微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法
本专利技术涉及微生物能力验证
，尤其涉及微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法。
技术介绍
能力验证是实验室外部质量控制的有效措施之一，也是计量从证和实验室认可的必备条件。实施微生物能力验证能够有效评估参与实验室进行相关微生物检验的技术能力。沙门氏菌作为近年我国食品中毒和食源性疾病常见的病原菌，是能力验证项目常选用的目标菌。但是目前，微生物学检验领域尚无高可信度、高通量的微生物能力验证制备技术，不确定因素较多，使得实验室间能力验证的可信度大打折扣。曹文博等在《食品安全质量检测学报》的2015年第6卷第1期公开了一种沙门氏菌能力验证样品的制备方法：采用真空冷冻干燥的方式制备样品，该方法在一定程度上提高了样品的稳定性和均匀性，但是仍然不够理想，且缺乏难度等级对比标准。现有的微生物能力验证沙门氏菌样品，样品的菌种稳定性较差，菌种的存活率也较低，且不同种类样品的验证难度不一，缺乏对比标准，因而使得微生物能力验证的意义也大打折扣。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，该方法制备的样品稳定性好，菌种存活率高，具有合理的不同难度等级标准。本专利技术的具体技术方案为：微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，以沙门氏菌为目标菌，以粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，包括如下步骤：(A)、菌株的复苏、增菌：将目标菌的标准菌和各干扰菌的标准菌分别加入到营养肉汤或营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使所述各标准菌复苏、生长和增菌，培养期间并对各菌株进行菌种鉴定。(B)、菌株的分离：当上述培养的沙门氏菌培养至稳定期时对其培养基进行离心分离，得到沙门氏菌菌泥；当每一种干扰菌培养至对数生长期后，对其培养基进行离心分离，得到各干扰菌菌泥。(C)、菌悬液的制备：简单级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阴性样品菌悬液。简单级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阳性样品菌悬液。中级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阴性样品菌悬液。中级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阳性样品菌悬液。困难级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阴性样品菌悬液。困难级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥、1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阳性样品菌悬液。上述份数均为重量份数；(D)、冷冻干燥和包装：分别称取上述制备的每种菌悬液1mL，并分别添加到各自的安瓶中，将所述安瓶平开盖放入冷冻干燥机中，在-22℃至-18℃温度下预先冻结7-9h，接着转移到温度为-50℃至-40℃的冷冻干燥机中，抽真空并使真空度达到100μmHg以上，然后将安瓶均匀放置于冷冻室内的隔板上，升华干燥45-55h；待安瓶内物质呈乳白色疏松海绵状时，对安瓶继续进行解析干燥1.5-2.5h；结束后对安瓶进行封口、压盖、贴签，制得微生物能力验证沙门氏菌样品，将所述样品贮存于4℃的环境中。本专利技术选用沙门氏菌为目标菌，选用粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，并且根据干扰菌与沙门氏菌检测时的相似程度，制备成三个难度等级样品组，每个样品组包括阳性样品和阴性样品。按本专利技术方法制备的样品，通过控制制备过程中的各项参数，使得样品中菌种的稳定性和存活率较高。作为优选，所述步骤(A)中各菌株的培养基中添加有海藻糖，所述海藻糖在培养基中的含量为2-4g/mL。在培养基中添加海藻糖的目的是，菌类在将海藻糖作为碳源进行吸收后，海藻糖能够进行菌类的细胞膜内部，当进行后续的冷冻干燥过程时，海藻糖的存在能够提高菌类的抗冻能力，使得细胞内的细胞液不易形成冰晶，避免了由于细胞内部的细胞液变成冰晶，升高了细胞的渗透压而导致菌类死亡的情况。作为优选，在所述步骤(B)中对培养有菌株的各个培养基进行分离前，将所述培养基放置于45-50℃的环境中1-2h。在进行分离前对培养基进行上述步骤，有利于菌株对培养基中海藻糖的吸收，有利于海藻糖进入菌株细胞内部。作为优选，在所述步骤(C)配制各菌悬液时，所述脱脂牛乳水溶液中还添加有壳聚糖和聚乙烯醇中的一种或多种。壳聚糖或聚乙烯醇的存在，在对菌悬液进行冷冻干燥时，作为对冷冻保护剂脱脂牛乳的补充，壳聚糖或聚乙烯醇在冷冻干燥过程中成为凝胶，具有众多的三维孔道结构，能够对菌株进行一定程度的包埋和吸附，形成了一个缓冲保护层，起到了一个隔离作用，在一定程度上削弱了极低温度对菌株的影响。此外壳聚糖和聚乙烯醇可被菌类自然分解，对菌类无害。作为优选，所述壳聚糖或聚乙烯醇在所述脱脂牛乳水溶液中的浓度均为0.2-0.5wt％。作为优选，所述聚乙烯醇的相对分子量为16000-20000。在此分子量范围的聚乙烯醇黏度较低，适合作为保护剂。作为优选，在所述步骤(D)中对所述安瓶进行封口和压盖时在冷冻干燥机的干燥箱内操作，且封口后安瓶内为真空状态。作为优选，在所述步骤(A)中对各标准菌进行复苏培养时，用接种环挑取一环菌株，并将其接种到10mL的培养基中。作为优选，在所述步骤(B)中配制各菌悬液时，所述脱脂牛乳水溶液的浓度为10wt％，菌悬液中目标菌的浓度为5×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为5×104cfu/mL。作为优选，在所述步骤(D)中，安瓶在的预先冻结温度为-20℃，预先冻结8h；接着转移到的冷冻干燥机的温度为-45℃；对安瓶的升华干燥时间为50h；对安瓶的解析干燥时间为2h。与现有技术对比，本专利技术的有益效果是：本专利技术方法制备的样品稳定性好，菌种存活率高，且具有合理的不同难度等级标准。附图说明图1是保存温度以及保存时间对实施例2中简单级阳性样品稳定性的影响。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的描述。实施例1微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，以沙门氏菌为目标菌，以粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，包括如下步骤：(A)、菌株的复苏、增菌：用接种环挑取一环各菌株本文档来自技高网...

【技术保护点】
微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，以沙门氏菌为目标菌，以粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，其特征在于包括如下步骤：(A)、菌株的复苏、增菌：将目标菌的标准菌和各干扰菌的标准菌分别加入到营养肉汤或营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使所述各标准菌复苏、生长和增菌，培养期间并对各菌株进行菌种鉴定；(B)、菌株的分离：当上述培养的沙门氏菌培养至稳定期时对其培养基进行离心分离，得到沙门氏菌菌泥；当每一种干扰菌培养至对数生长期后，对其培养基进行离心分离，得到各干扰菌菌泥；(C)、菌悬液的制备：简单级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为8‑12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液的浓度为(3‑7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阴性样品菌悬液；简单级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为8‑12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3‑7)×102 cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3‑7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阳性样品菌悬液；中级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8‑12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3‑7)×102 cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3‑7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阴性样品菌悬液；中级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8‑12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3‑7)×102 cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3‑7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阳性样品菌悬液；困难级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8‑12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3‑7)×102 cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3‑7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阴性样品菌悬液；困难级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥、1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8‑12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3‑7)×102 cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3‑7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阳性样品菌悬液；上述份数均为重量份数；(D)、冷冻干燥和包装：分别称取上述制备的每种菌悬液1mL，并分别添加到各自的安瓶中，将所述安瓶平开盖放入冷冻干燥机中，在‑22℃至‑18℃温度下预先冻结7‑9h，接着转移到温度为‑50℃至‑40℃的冷冻干燥机中，抽真空并使真空度达到100Hg以上，然后将安瓶均匀放置于冷冻室内的隔板上，升华干燥45‑55h；待安瓶内物质呈乳白色疏松海绵状时，对安瓶继续进行解析干燥1.5‑2.5h；结束后对安瓶进行封口、压盖、贴签，制得微生物能力验证沙门氏菌样品，将所述样品贮存于4℃的环境中。...

【技术特征摘要】
1.微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，以沙门氏菌为目标菌，以粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，其特征在于包括如下步骤：(A)、菌株的复苏、增菌：将目标菌的标准菌和各干扰菌的标准菌分别加入到营养肉汤或营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使所述各标准菌复苏、生长和增菌，培养期间并对各菌株进行菌种鉴定；其中各菌株的培养基中添加有海藻糖，所述海藻糖在培养基中的含量为2-4g/mL；(B)、菌株的分离：当上述培养的沙门氏菌培养至稳定期时对其培养基进行离心分离，得到沙门氏菌菌泥；当每一种干扰菌培养至对数生长期后，对其培养基进行离心分离，得到各干扰菌菌泥，其中对培养有菌株的各个培养基进行分离前，将所述培养基放置于45-50℃的环境中1-2h；(C)、菌悬液的制备：简单级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阴性样品菌悬液；简单级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102cfu/mL，干扰菌的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阳性样品菌悬液；中级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，各干扰菌的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阴性样品菌悬液；中级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥、1份大肠杆菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阳性样品菌悬液；困难级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt％的脱脂牛乳水溶液中，各干扰菌的浓度为(3-7)×104cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阴性样品菌悬液；困难级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡兴娟，沈飚，邵宏宏，周秀锦，徐君辉，杨赛军，
申请(专利权)人：舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33