本发明专利技术提供了一种拟无枝酸菌WP1在制备革兰氏致病菌活性抑制剂中的应用；本发明专利技术拟无枝酸菌WP1营养要求简单、容易培养，且发酵培养代谢产物具有抑菌活性；本发明专利技术拟无枝酸菌WP1的次级代谢产物，即发酵液乙酸乙酯浸提制备的总浸膏分别对金黄色葡萄球菌，蜡样芽胞杆菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌的生长均有一定的抑制活性。
【技术实现步骤摘要】
拟无枝酸菌WP1在制备革兰氏菌活性抑制剂中的应用(一)
本专利技术涉及一株海洋放线菌-拟无枝酸菌(Amycolatopsissp.)WP1在制备抑菌活性物质中的应用。(二)
技术介绍
致病菌是能够引起疾病的微生物，寻找抑菌活性强的物质成为人类攻克疾病的主要工作之一，海洋微生物代谢产物研究是近年来国际上新兴的研究课题。随着陆生资源的开发，人类面临资源匮乏的危机，开发海洋资源成为热潮。海洋微生物的生长环境苛刻，使其具有与陆地生物完全不同的代谢系统，加之物种的多样性，便决定了其能产生许多结构新颖、活性特异的次级代谢产物。研究表明，它们中许多成分也具有抗菌，抗癌等药用价值。因此海洋微生物代谢产物的研究成为了发现新型抑菌活性物质的新途径，为新药研制开发和海洋资源利用打下坚实基础。抑菌圈法是筛选抑菌活性比较常用的一种筛选方法，常用的有牛津杯法等。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株具有抑菌活性的海洋放线菌—拟无枝酸菌Amycolatopsissp.WP1在筛选抑菌活性物质中的应用，特别是在制备革兰氏致病菌活性抑制剂中的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种拟无枝酸菌(Amycolatopsissp.)WP1在制备革兰氏致病菌活性抑制剂中的应用。所述拟无枝酸菌(Amycolatopsissp.)WP1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号：(CGMCCNo.10738)，保藏日期(2015年04月23日)，所述拟无枝酸菌(Amycolatopsissp.)WP1已在专利申请中公开，专利申请号：201510356936.2。本专利技术所述拟无枝酸菌WP1由西南印度洋63.50E，27.89S，2945米以下的泥土样品中分离筛选得到，菌落特征如下：涂布或划线接种于放线菌2号平板培养基上生长迅速，30～37℃培养24～48h后长出圆形、白色、直径约0.1～0.2cm的菌落；该菌株的菌体生长特征如下：在放线菌2号液体培养基中，30～37℃培养24～48h后菌体呈细小颗粒状生长。优选的，所述革兰氏致病菌为革兰氏阳性致病菌或革兰氏阴性致病菌活性抑制剂，更优选革兰氏阳性致病菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)或蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)；革兰氏阴性致病菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)或铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。本专利技术所述活性抑制剂制备方法为：将拟无枝酸菌WP1经发酵培养获得的发酵液超声破碎(优选4℃下超声破碎)，将破碎混合液离心(或过滤)(优选4℃、8000r/min条件下离心10min)，取上清液用乙酸乙酯萃取，将上层有机相减压浓缩至浸膏，获得活性抑制剂。本专利技术所述拟无枝酸菌WP1发酵液制备方法为：将拟无枝酸菌WP1接种至发酵培养基中，于30～37℃、150～200r/min振荡条件下培养3～7d，得到发酵液；所述发酵培养基组成为：酵母提取物3～7g/L，麦芽提取物7～15g/L，葡萄糖3～7g/L，溶剂为人工海水，pH7.2～8.0；优选所述发酵培养基组成为：酵母提取物4.0g/L，麦芽提取物10.0g/L，葡萄糖4.0g/L，溶剂为人工海水，pH7.2～8.0；所述每100mL人工海水组成为：NaCl2.448g，Na2SO40.3917g，KCl0.0664g，KBr0.0096g，SrCl20.0024g，MgCl·6H2O0.4981g，CaCl2·H2O0.1102g，NaHCO30.0192g，H3BO30.0026g，NaF0.0004g，蒸馏水100mL。所述菌株在发酵培养前，通常需要先经斜面培养活化，然后经种子培养，获得种子液，再接入发酵培养基进行培养，具体为：(1)斜面培养为：将拟无枝酸菌WP1接种至斜面培养基，30～37℃培养24～48h，得到活化后的菌种；所述的斜面培养基组成为：酵母提取物3.0～7.0g/L，麦芽提取物7.0～15.0g/L，葡萄糖3.0～7.0g/L，琼脂15～35g/L，溶剂为人工海水，pH7.2～8.0，所述人工海水组成同发酵培养基；(2)将步骤(1)活化培养后的菌株接种至液体种子培养基中，于30～37℃，150～200r/min振荡条件下培养24～48h，得到种子液；所述的种子培养基组成为：酵母提取物3.0～7.0g/L，麦芽提取物7.0～15.0g/L，葡萄糖3.0～7.0g/L，溶剂为人工海水，pH7.2～8.0，所述人工海水组成同发酵培养基；(3)将步骤(2)种子液以体积浓度5％～10％的接种量，移种到发酵培养基中，于30～37℃、150～200r/min振荡条件下培养3～7d后，得到发酵液。本专利技术所述革兰氏致病菌活性抑制剂以浓度为6～7mg/mL甲醇溶液的形式进行抑菌反应，优选6.4mg/mL，每1×106～1×107CFU待测菌所需抑菌剂为0.6～0.7mg。本专利技术的有益效果主要体现在：(1)本专利技术拟无枝酸菌WP1营养要求简单、容易培养，且发酵培养代谢产物具有抑菌活性；(2)本专利技术拟无枝酸菌WP1的次级代谢产物，即发酵液乙酸乙酯浸提制备的总浸膏分别对金黄色葡萄球菌，蜡样芽胞杆菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌的生长均有一定的抑制活性。(四)附图说明图1为平板培养基上拟无枝酸菌WP1的菌落形态；图2为光学显微镜下拟无枝酸菌WP1的菌体形态，显微放大1000倍。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：拟无枝酸菌WP1的筛选及分离鉴定1，生物材料及培养基：用于分离海洋拟无枝酸菌WP1的生物材料为采自西南印度洋63.50E，27.89S，2945米深的沉积物样品。用于菌株WP1分离所用的培养基为海水琼脂培养基，配方为：人工海水1L，琼脂粉15g，pH7.2-7.6；人工海水配方为：NaCl24.477g、MgCl2·6H2O4.981g、Na2SO43.917g、CaCl2·2H2O1.102g、KCl0.664g、NaHCO30.192g、KBr0.096g、H3BO30.026g、SrCl20.024g、NaF0.0039g及蒸馏水1000mL。2，样品处理：称取1g沉积物样品，溶于45ml人工海水中(内加10颗左右玻璃珠)，28℃摇床中200rpm振荡2h，取200μl涂布至含终浓度为50μg/mL制霉菌素和50μg/mL萘啶酮酸的海水琼脂培养基上。3，拟无枝酸菌WP1的纯培养：将涂布悬浊液的分离培养基置于28℃恒温培养箱中倒置培养，培养14天左右开始挑取培养基上生长的单菌落进行转接纯化，将纯化好的WP1单菌落，接种于海水琼脂培养基中，于28℃培养箱中培养后，置于4℃冰箱保存备用。4，拟无枝酸菌WP1的分子鉴定：用热破壁法提取菌株的基因组DNA，采用国际细菌鉴定通用引物(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后利用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)WP1在制备革兰氏菌活性抑制剂中的应用，所述拟无枝酸菌WP1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.10738，保藏日期2015年04月23日，保藏地址：中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
【技术特征摘要】
1.一种拟无枝酸菌（Amycolatopsissp.）WP1在制备革兰氏菌活性抑制剂中的应用，所述拟无枝酸菌WP1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.10738，保藏日期2015年04月23日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述革兰氏菌为金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌或铜绿假单胞菌。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述活性抑制剂制备方法为：将拟无枝酸菌WP1经发酵培养获得的发酵液超声破碎，将破碎混合液离心，取上清液用乙酸乙酯萃取，将上层有机相减压浓缩至浸膏，获得活性抑制剂。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述拟无枝酸菌WP1发酵液制备方法为：将拟无枝酸菌WP1接种至液体发酵培养基中，于30~37℃、150~200r/min振荡条件下培养3~7d，得到发酵液；所述发酵培养基组成为：酵母提取物3~7g/L，麦芽提取物7~15g/L，葡萄糖3~7g/L，溶剂为人工海水，pH7.2~8.0；所述人工海水每100ml组成为：NaCl2.448g，Na2SO40.3917g，KCl0.0664g，KBr0.009...
【专利技术属性】
技术研发人员：王鸿，吴祺豪，陈苏，张改云，李钰金，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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