化学交联剂制造技术

本文披露了化学缀合的方法，该方法包含使溶酶体酶与第一交联剂接触以引入醛基；使溶酶体靶向肽与第二交联剂接触以在N-末端残基处引入酰肼基；使步骤a.中具有醛基的溶酶体酶与步骤b中在N-末端残基处具有酰肼基的溶酶体靶向肽接触；并且形成溶酶体酶-溶酶体靶向肽缀合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】化学交联剂 本申请要求于2013年3月15日提交的美国序列号61/794, 784的权益。 专利
所披露的专利技术包总体上设及用于化学交联的组合物和方法。
技术介绍
溶酶体是细胞内专口的细胞器，运些细胞器降解并再循环蛋白质、各种脂质（包 括糖脂类和胆固醇）W及碳水化合物类成为它们的主要成分，运些成分使新蛋白质、膜成 分和其他分子能够合成。细胞也会利用溶酶体通过称为自体吞隧的自适应细胞过程来帮 助维持内环境稳定W及细胞健康，该过程增加溶酶体的活性来提供额外的氨基酸用于增加 多种蛋白质（例如抗体和干扰素类）的生物合成并且来供给营养素用于能量产生W应对 营养不足或者病毒感染的应激时期。每个代谢过程被一种特异的驻留溶酶体酶催化。基 因突变能够导致溶酶体生物活性的缺陷，其改变代谢过程而且引起临床疾病。溶酶体胆积 失调（LSD)是一类大约50种不同的人类代谢疾病，其由特定的溶酶体蛋白的缺失引起，导 致内涵体/溶酶体隔室内各种物质的积累。许多此类疾病已经得到良好表征W理解溶酶 体蛋白不足和其导致的代谢缺陷。例如，存在许多具有改变的糖脂分解代谢的LSD，例如戈 谢氏病（Gaucher)、法布里氏病（F油巧）W及泰-萨克斯病/山德霍夫氏病灯ay-Sachs/ San化off)。尼曼-皮克病C(Neimann-PickC)的特征是受损的脂质和胆固醇代谢，而例 如糖原胆积症II型（蓬佩病（Pompe))和III型（科里-福布斯病（Cor巧-Forbes))等具 有改变的碳水化合物代谢的疾病也已经得到了表征。其他LSD改变骨骼或细胞外基质代谢 (例如，黏多糖沉积症（MPSI-VII)，戈谢氏病（Gaucher))W及蛋白质周转（神经元蜡样脂 褐质沉积症；己登氏病度atten)，等）。而LSD相对少见，它们能够引起严重的慢性疾病并 且如果没有有效的治疗经常会导致死亡。 尚无溶酶体胆存病的治愈法，但是针对各种LSD已进行了大量不同治疗方法的研 究，包括骨髓和厮带血移植、酶替代疗法巧RT)、底物还原疗法（SRT)W及药物分子伴侣疗 法。基因治疗也正在研发但还没有在临床中测试。在运些治疗方法中，ERT是最为成熟的， 多种ERT被批准用于治疗各种LSD，包括戈谢氏病、法布里氏病、蓬佩病、MPSI、MPSIIW及 MPSVI，而一种SRT药物被批准用于治疗戈谢氏病。 阳0化]ERT治疗溶酶体胆存病的理念相当简单，即将一种重组的人类溶酶体酶施用于患 者W补充缺乏的生物活性并且改善临床症状。然而，不像其他主要在细胞表面或细胞外发 挥作用的蛋白质治疗处理（例如抗-VEGF和其他抗体、促红细胞生成素、凝血因子等），溶酶 体酶必须在细胞内发挥作用，在溶酶体内，因此要使用一种从外部进入细胞随后递送至运 些内部隔室的机制。在哺乳动物中，用于大多数可溶的溶酶体酶的在某些天冬酷胺残基（N 联寡糖；N-聚糖）的蛋白质骨架上的分支碳水化合物结构是在翻译后修饰形成被称为甘露 糖6-憐酸（M6巧的专口碳水化合物结构。M6P是鉴别和运输通过膜结合的M6P受体从高 尔基体向溶酶体的新合成的溶酶体蛋白的天然生物信号。一类M6P受体（不依赖阳离子的 M6P受体；CI-MPR)也循环至质膜并且具有结合和内化外源溶酶体蛋白的功能性活性。据认 为CI-MPR已经进化到重新俘获逃离细胞的溶酶体蛋白（通过细胞向外分泌），因此提供了 一种内化外源溶酶体蛋白的祀向机制并且是针对各种LSD的酶替代疗法的基础。 已经显示，重组的溶酶体酶替代疗法是总体上安全的，但是它们用于减少临床症 状的效力差异很大。例如：法布瑞酶"(。油razyme?)(重组酸性a-半乳糖巧酶A;基因 酶公司（GenzymeCo巧.；0ERTW每两周Img/kg体重的剂量足W从内皮细胞清除法布里病 中累积的底物，而W每两周40mg/kg的孤儿药?(Myozyme?)(重组人类酸性a-葡糖巧酶， riiGAA;基因酶公司）的剂量对蓬佩病仅仅中度有效。疗效差异主要归因于M6P含量的不同， W至于低水平的M6P与药物祀向性差和疗效低相关。重组溶酶体酶的生产非常具有挑战 性，因为控制碳水化合物加工，尤其是哺乳动物表达系统中的M6P水平，是极为困难的。两 种专口的高尔基体酶催化M6P修饰；N-乙酷葡糖胺憐酸转移酶添加憐酸联N-乙酷葡糖胺 至某些末端甘露糖残基，而N-乙酷葡糖胺-^憐酸二醋a-乙酷葡糖胺糖巧酶（也称为去 覆盖酶）移除覆盖N-乙酷葡糖胺W掲示M6P信号。然而，N-乙酷葡糖胺憐酸转移酶在细胞 中是限制性的，而且该生化反应对于各种溶酶体蛋白是固有地低效的。在生产过程中，溶酶 体蛋白的过度表达极大地加重了运一问题并且导致M6P量高度可变。因此，碳水化合物加 工通常是不完整的并且导致重组溶酶体酶的生产伴有N-聚糖混合物，运些混合物含M6P、 非M6P结构的高甘露糖型N-聚糖和络合物类型N-聚糖（对分泌性蛋白是典型的）。使事 情复杂化的是死细胞或受损细胞释放出例如憐酸酶的酶进入细胞培养基，其移除M6P。因 此，减少的M6P含量降低重组溶酶体酶对M6P受体的结合亲和力并且降低其细胞摄取并且 因此降低药物疗效。死细胞或受损细胞释放出其他糖巧酶移除其他碳水化合物（例如唾液 酸、半乳糖等），W显示通常不显露的内部的碳水化合物，并且运些N-聚糖易于被鉴定为异 常。运些不完整的N-聚糖结构增加重组的溶酶体蛋白从循环中的清除率，运也会降低药物 疗效。因此就需要较高的药物剂量来补偿降低的疗效。然而，较高的药物剂量需求具有多 项负面影响：（1)较高的药物剂量对增加一项原本已经昂贵的治疗是成本高昂的；(2)较高 的药物剂量需要长的输注时间；(3)大量的循环药物导致显著的抗体反应（可见于大多数 蓬佩病患者）并且在输注过程中大量患者也经历了过敏反应。美国食品药品管理局（抑A) 已经针对孤儿药（Myozyme)发布了 "黑标签警告"，该药物是典型的最初给药十分缓慢但是 在输注过程中提升。运一举措有助于减轻过敏反应但是显著地延长了输注时间，12-虹输注 不是罕见的。 阳007] -种潜在的用于改善各种溶酶体ERT药物寻祀的策略采用祀向肤有效地让ERT祀 向溶酶体，无需要传统的M6P碳水化合物结构。运从概念上说是可行的，因为不依赖阳离子 的M6P受体包含了针对一种被称为膜岛素样生长因子2(IGF-。的小肤的独特的结合域，并 且因此运种受体被称为IGF-2/ (IGF-2/CI-MPR)。实际上，该受体对内化外源具有M6P的溶 酶体蛋白全权负责，因为IGF-2/CI-MPR存在并且在细胞表面具有生物活性。另外一类M6P 受体，依赖阳离子的M6P受体（CD-MPR)，仅参与细胞内溶酶体蛋白的运输，因为它在细胞表 面不具有生物活性而且缺少IGF-2肤结合域。该IGF-2/CI-MH?针对M6P具有两个分离的结 合位点（分别是域1-3和7-9)W使得其W适度的亲和性结合单-M6PN-聚糖（N-聚糖上 的1个M6P残基）或者W大约3000倍的更高的亲和性结合双-M6PN-聚糖（同一个N-聚 糖上的两个M6P残基）。由于溶酶体蛋白包含复合（无M6巧、单-W及双-M6PN-聚糖的 混合物，它们对于IGF-2/CI-Mra的亲和性根据具有M6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种化学缀合的方法，包括：a.使溶酶体酶与第一交联剂接触以引入醛基；b.使溶酶体靶向肽与第二交联剂接触以在N‑末端残基处引入酰肼基；c.使步骤a.中具有醛基的溶酶体酶与步骤b中在N‑末端残基处具有酰肼基的溶酶体靶向肽接触；并且d.形成溶酶体酶‑溶酶体靶向肽缀合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·杜，
申请(专利权)人：阿米库斯治疗学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US