本发明专利技术涉及一种基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，所述的联合分析法包括：定时定量PCR获取鱼类的总DNA丰度；454 GS-FLX Titanium测序分析鱼类物种组成比例；测序数据和实时定量PCR数据联合分析目标物种；使用sufer 8.0软件完成对环境中鱼类线粒体DNA相对分布图绘制。本发明专利技术基于环境DNA鉴定技术，不依赖于鱼类物种的捕获，只需要采集水体样品即可对物种的有无和多少进行分析，采样方法简单，且可以最大限度的保护鱼类资源；同时，对于一些分布较少难以捕获的物种，该方法也较传统捕捞调查更为有效，本方法能够有效的解决样品中存在多种近缘物种条件下难以得到有效的物种特异性引物的问题，且只需要上述两种技术各进行一次实验，即了解所有物种的DNA丰度信息。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及分子生态学的鱼类数量评估
，尤其设及水体环境DNA的样品 对近缘种鱼类的鉴定区分W及定量的分析，具体是指一种基于环境DNA技术对鱼类DNA丰 度估算的联合分析法。
技术介绍
国内目前用于鱼类数量的方法主要有标记重捕法和声学探测法。标记重捕法是通 过对水体中的鱼类进行标记后捕拱，进行鱼类物种数量的统计。该方法的实现主要是通过 各种标记和捕拱工具（如各种网具、钓具、电捕等）对于鱼类进行捕获而完成。该方法存在 W下几方面的问题：1、标记的选取及放置工作需要大量的工作，损耗人力、物力。2、重捕强 度要求高。需要通过大量的捕拱工作，并且需要足够大的重捕数量，成本投入较大且难W保 证准确性。3、该方法需要捕获活体，难W保证被捕获鱼类的存活，对于鱼类资源有一定的破 坏。4、对于稀有物种、外来物种的监测调查由于其数量稀少，无法有效进行标记和重捕，难 W取得良好的效果，调查结果更加容易产生偏差。 声学探测法利用回声探测仪对各个水体的鱼类资源状况进行了评估。研究通过回 声成像，并充分结合分层拖网的鱼类取样，进行积分分配，从而得到目标强度与鱼体长度的 换算关系式，最后估算水域鱼类资源量及分布，其结果相对捕拱法更为准确。然而该技术还 是要建立在捕拱的基础上，不仅存在上述的问题，该技术还受到水域理化指标和天气状况 的限制，而且对于大面积水域的调查仍有很大的局限性。在物种鉴定方面，该方法也无法实 现准确有效的物种鉴定和群落结构的分析。对鱼群数量的估计也并不具有可靠性。 环境DNA是指从有机体脱落释放进入到自然环境中（如空气、水、±壤等）的DNA， 包括细胞中的DNA和细胞破碎后游离出细胞外的DNA分子。环境DNA技术就是直接从水、 ±壤、沉积物等环境样本中提取DNA片段，后通过DNA二代测序和实时定量PCR等分子生物 学检测技术来定性或定量目标生物，从而确定目标生物在该环境中的分布及功能特征的研 究方法。环境DNA的应用最早是从±壤、沉积物中直接提取出来DNA基因组，用来研究微生 物多样性W及物种鉴定，后来在生态学的研究中关于环境DNA的应用得到进一步的发展， 逐渐从微生物学拓展到了动植物学研究领域中。由于水环境的特殊性，加上水生动物在水 中的流动性、易躲藏、不易捕拱等特点，在大面积的水域中有关水生动物方面的调查研究往 往费时费力不易进行。但是环境DNA的应用为我们在水生动物资源调查方面提供了一条良 好的思路。 而在环境DNA的研究分析当中，国外多用于对于外来物种和稀有物种的监测，比 如，在北美淡水生态系统中对于入侵亚洲經鱼的监测，W及日本对于蓝觸太阳鱼入侵的监 。研究采用qPCR方法，设计一套针对目标物种线粒体基因序列的特异的引物和探针，即 可完成对于目标物种的DNA丰度的测算，并且通过DNA的丰度进而来评估目标物种的生物 量丰度。但是，运些物种由于在研究地属于归化物种，生态系统中其他物种与其亲缘关系很 远，因此在对运些物种进行研究时，获得扩增运些物种的特异的引物序列是容易的。而当我 们在研究一些重要的本±物种时，如經科鱼类的某些物种，由于大量近缘物种的存在，在对 包含有多种物种的DNA的混合的环境DNA样品进行线粒体基因的扩增时，往往很难获取有 效的物种特异引物，运一问题使得我们通过直接定量PCR的方法，难W获取目标物种的DNA 丰度信息，运一问题尚未得到有效解决。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种不依赖物种特异引物， 而采用鱼类线粒体通用引物进行二代测序技术（如454测序）和实时定量PCR(qPCR)联合 分析获取目标物种DNA丰度评价鱼类分布的方法。 为了实现上述目的，本专利技术具有如下构成： 该基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其主要特点是，所述的联 合分析法包括： 定时定量PCR获取鱼类的总DNA丰度，在设计好的通用引物下构建DNA标准品，扩 增后提取DNAW制作标准曲线； 将待测试的各环境DNA样本在标准品条件下进行反应，反应后带入标准曲线W获 得各环境样点的DNA相对丰度拷贝数； 454GS-FLXTitanium测序分析鱼类物种组成比例； 测序数据和实时定量PCR数据联合分析目标物种，计算公式为：目标物种线粒体 基因拷贝数=实时定量PCR定量的鱼类总线粒体基因拷贝数X二代454测序获得的目标 物种线粒体序列的百分比； 使用SUfer8.0软件完成对环境中鱼类线粒体DNA相对分布图绘制。 优选地，所述的各环境DNA样本为提前根据水域大小，设置样点并采集柱状水层 混合后的水样冷藏，在实验室中抽滤，后提取DNA冷藏备用。 更优选地，所述的水样在24h内进行抽滤处理，滤膜孔径为1.2ym，抽滤后使用 DNA提取试剂盒提取滤膜中的所有环境DNA，提取好的DNA在-20°C条件下保存备用。 进一步优选地，所述的通用引物选择在16srRNA基因区域进行通用引物和探针设 计，所设置的16srRNA基因正向引物序列为SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列；16srRNA基 因反向引物序列为SEQIDN0:2所示的核巧酸序列；16srRNA基因探针序列为SEQIDN0:3 所示的核巧酸序列。 更进一步优选地，所述的标准曲线制备过程具体如下：[001引扩增包含检测目的的鱼类线粒体16s rDNA基因部分序列，进行PCR反应，反应产 物经电泳检测后，采用TIANgel Midi Purification Kit,对PCR产物进行回收纯化； 将所述的PCR产物连接到PMD19-T载体上，转化入感受态细胞中，挑选菌斑进行培 养，提取质粒后进行限制性内切酶处理，琼脂糖凝胶电泳；DNA胶回收后进行浓度测定，在A260/A280大于1. 8的情形下，按下述公式计算质 粒拷贝数：拷贝数= 6.02X1023X质粒浓度（ng/iiL)/化48X质粒总长度）（g/mol); 质粒总长度=2692bp+PCR产物长度； 其中，6. 02X1023是阿佛加德罗常数；648是每个碱基的平均分子量；[002引 使用EASYDilution将构建的DNA标准品分别按照1X10\ 1X106、1X105、1X104、 I XlO3、I XlO2、I X IQicopies/yL梯度稀释作为模板进行Real Time PCR反应，制作DNA标 准曲线，每种浓度标准质粒设3个重复，并做无模板对照； 对构建的DNA标准品进行扩增反应，反应采用两步法：95°C80s预变性；95°C变性 5s，55°C退火10s，72°C延伸21s，45个循环，反应结束后得到各自的Ct值，WCt值为纵坐 标，起始模板浓度的对数作为横坐标，制作标准曲线。 再进一步优选地，所述的各环境样点的DNA相对丰度拷贝数的测定过程具体如 下： 反应条件和体系与制作标准品曲线时相同，各环境DNA样本不做稀释直接添加， 每个样本设置2个平行，计算变异系数；反应后得到样品Ct值，把待测样品的Ct值代入标 准曲线表达式可W算出它的初始拷贝数；由拷贝数可知所测物种在各样点的DNA相对丰度 情况。 最优选地，所述的454GS-FLXTitanium测序分析鱼类物种组成比例具体为：[002引选取16srRNA基因为引物，其中所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其特征在于，所述的联合分析法包括：定时定量PCR获取鱼类的总DNA丰度，在设计好的通用引物下构建DNA标准品，扩增后提取DNA以制作标准曲线；将待测试的各环境DNA样本在标准品条件下进行反应，反应后带入标准曲线以获得各环境样点的DNA相对丰度拷贝数；454GS‑FLX Titanium测序分析鱼类物种组成比例；测序数据和实时定量PCR数据联合分析目标物种，计算公式为：目标物种线粒体基因拷贝数＝实时定量PCR定量的鱼类总线粒体基因拷贝数×二代454测序获得的目标物种线粒体序列的百分比；使用sufer 8.0软件完成对环境中鱼类线粒体DNA相对分布图绘制。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘其根，苏超群，赵良杰，刘军，胡忠军，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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