本发明专利技术涉及一种三甲基化壳聚糖–接枝–聚乙二醇–REDV共聚物及制备方法。首先三甲基化壳聚糖与邻二硫吡啶–聚乙二醇–琥珀酰亚胺乙酸酯进行反应,得到三甲基化壳聚糖–接枝–聚乙二醇–邻二硫吡啶共聚物。然后加入特异性小肽精氨酸–谷氨酸–天冬氨酸–缬氨酸–半胱氨酸,通过共聚物中邻二硫吡啶基团和小肽中巯基进行偶联反应,制得三甲基化壳聚糖–接枝–聚乙二醇–REDV共聚物。本发明专利技术的优点是室温反应,过程简单；共聚物带有正电荷可与带有负电荷核酸通过静电作用复合得到纳米粒子；与基因复合后的纳米粒子在水溶液中分散性好,粒径较均一,电位为正值,具有稳定、靶向内皮细胞和转染效率高的优点,用于医药基因治疗领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及了一种三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物及制备方法， 属于医药基因治疗领域。
技术介绍
目前，siRNA和miRNA作为基因表达的重要调控者，具有特异性高、作用 迅速和高效等优点，在治疗癌症、骨和血管疾病中发挥重要积极作用，受到广大研 究人员的关注(MuthiahM,ParkI,ChoC.Nanoparticle-mediateddeliveryof therapeuticgenes:focusonmiRNAtherapeutics.ExpertOpin.DrugDeliv 2013, 10(9)，1259-1273)。 SiRNA和miRNA本身易于受到核酸酶的降解，因此研究具有较高转染效率的载体， 携带基因到达病灶部位并发挥基因的作用，成为一个重要的研究课题。三甲基化壳聚糖 (TMC)是壳聚糖的一种衍生物具有良好的生物相容性、可降解性、良好的水溶性以及复合基 因的能力，并广泛的应用于药物载体和医用辅助材料。聚乙二醇（PEG)具有良好的亲水性， 在TMC上引入PEG链段，有利于提高TMC在水中的溶解性和载体的稳定性，降低TMC的细胞 毒性。 使用含有双端基官能团的聚乙二醇，可将三甲基化壳聚糖与具有脑靶向功能的多 肽RVG(序列为YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)连接，形成三甲基壳聚糖-接枝-聚乙 二醇-RVG，并应用于基因治疗领域，有助于实现核酸类药物通过血脑屏障和脑主动靶向定 位，并提高了核酸的稳定性和转染效率（姜同英，王思玲，高亦鲲.一种三甲基壳聚糖-接 枝-聚乙二醇/核酸脑靶向胶束及其制备方法.CN103182087B，2015)。其中，借助了功能肽 RVG上的巯基与PEG-端的马来酰亚胺基团、乙烯砜基团或硫醇基团反应。 精氨酸_谷氨酸-天冬氨酸-缴氨酸（Arg-Glu-Asp-Val,REDV)存在于纤维连接 蛋白的III-CS区域。有研究表明，含有REDV序列合成肽的基板能够特异性地粘附血管内 皮细胞，而不粘附平滑肌细胞和成纤维细胞（HubbellJA，MassiaSP，DesaiNP，Drumheller PD.Endothelialcell-selectivematerialsfortissueengineeringinthevascular graftviaanewreceptor.NatureBiotechnology, 1991，9 (6):568-572)〇 本专利技术进一步扩展了三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇_小肽的合成方法和应 用范围。使用含有双端基官能团的邻二硫吡啶-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯，通过其中 的二硫键将具有特异性粘附血管内皮细胞的功能小肽REDV与PEG连接而形成三甲基化壳 聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物，可以缩短合成时间。该三甲基化壳聚糖-接枝-聚 乙二醇-REDV共聚物制备方法的优点是室温反应，反应过程简单。制备的带有正电荷的共 聚物与带有负电荷核酸等通过静电作用复合得到纳米粒子。该纳米粒子在水溶液中分散性 好，粒径较均一，电位为正值，具有稳定性好、靶向内皮细胞和转染效率高的优点，用于医药 基因治疗领域。
技术实现思路
本专利技术的目的在于制备一种三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物。 本专利技术的技术方案如下： 上述三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物的结构式为： 上述的三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物，其特征在于所述壳聚 糖的重均分子量为50KDa，壳聚糖脱乙酰度大于95%;三甲基化壳聚糖的甲基化度为30~ 50%〇 上述三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物，其特征在于所述聚乙二醇 的分子量为3~5KDa，聚乙二醇的双端的活性基团分别为琥珀酰亚胺基团和吡啶基二硫基 团；聚乙二醇的接枝率为5~50%，。 上述三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物，其特征在于所述REDV小肽 为精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-半胱氨酸（REDV-Cys)及其他可以靶向内皮细胞 的多肽。 上述三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物的制备方法，包括以下步骤： (1)制备三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶共聚物； (2)制备三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物。 所述的步骤（1)制备三甲基化壳聚糖_接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶共聚物：原 料邻二硫吡啶-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯和TMC的质量比为1~5:1，TMC的浓度为 10mg/mL，去离子水作为溶剂，室温下反应3~10h。产物使用去离子水透析，最后冻干得 到三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶共聚物。 所述的步骤（2)制备三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物：三甲基化 壳聚糖-接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶共聚物和REDV小肽的质量比为10~20: 1，REDV小 肽的浓度为0.25~0.5mg/mL,去离子水为溶剂，室温反应2~6h。未参加反应的小肽通 过离心超滤并透析除去，制得三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物。 上述三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物可与带负电荷的核酸自组装 为纳米粒子，其特征在于包括步骤：将制备的三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV溶 解于焦碳酸二乙酯（DEPC)处理过的水中与核酸溶液进行混合，室温静置30min。 上述纳米粒子，其特征在于制备的纳米粒子的动态光散射测试的粒径在50~ 500nm之间，G电位在2~30mV之间，靶向血管内皮细胞，用于医药基因治疗领域。 本专利技术公布了一种三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物的制备方 法。首先三甲基化壳聚糖与邻二硫吡啶-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯进行反应，得 到三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶共聚物。然后加入特异性小肽精氨 酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-半胱氨酸（REDV-Cys)，通过共聚物中邻二硫吡啶 基团和小肽中巯基进行偶联反应，制得三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚 物。该制备方法的优点是室温反应，反应过程简单。本专利技术的共聚物带有正电荷可与带有 负电荷核酸通过静电作用复合得到纳米粒子。与基因复合后的纳米粒子在水溶液中分散性 好，粒径较均一，电位为正值，具有稳定、靶向内皮细胞和转染效率高的优点，用于医药 基因治疗领域。【附图说明】 图1 :实施例1制备的三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物与miRNA复 合的纳米粒子的透射电子显微镜照片。【具体实施方式】 下面通过实施案例对本专利技术的技术方案作进一步的描述，以下实施案例是对本发 明的进一步说明，并不限制本专利技术的适用范围。 实施例1 : 在装有磁力搅拌的三口瓶中，将lg壳聚糖（M.=5、丨04 )和2. 4g碘化钠加入到 5. 6mL质量分数为15%的NaOH和40mLN-甲基-2-吡咯烷酮的混合溶液中，并加入6mL 碘甲烷，在60°C下回流反应45min。再加入5. 6mL的15%NaOH溶液和3mL的碘甲烷，搅 拌反应45min。之后加入40mL乙醇来终止反应，将产物过滤并使用乙醚洗涤。最后，将产 物溶解在40mL质量分数为10%NaCl溶液中，搅拌3h。产物使用去离子水透析本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种三甲基化壳聚糖‑接枝‑聚乙二醇‑REDV共聚物,其特征在于结构式为：
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：袁晓燕，周芳，赵蕴慧，任丽霞，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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