本发明专利技术涉及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，有效解决现有ELISA检测HIV-1抗体的方法检测窗口期长，易漏检及HIV-1 P24抗体检测的试剂盒假阳性率高，特异性低的问题，该试剂盒内设有预包被HIV-1 P24抗原酶标板，阴性对照液血清、阳性对照液血清、辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体、抗体稀释液、显色剂TMB A液和显色剂TMB B液、终止液、洗涤液、封板膜，本发明专利技术利获取到新的HIV-1 P24基因序列，并用此序列基因重组表达抗原蛋白包被ELISA，经间接法检测样本HIV-1 P24抗体，有效用于HIV-1感染的早期辅助诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种人类免疫缺陷病毒I型P24抗体检测ELISA试剂盒。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV)是艾滋病的病原体能 攻击人体免疫系统的病毒，它把人体免疫系统中最重要的T淋巴细胞作为主要攻击目标， 大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能。因此，人体易于感染各种疾病，并可发生恶性肿瘤， 病死率较高。由于其基因易突变，到目前为止还未有特效的防治疫苗，所以防治艾滋病仍是 以早发现缩小隐形感染传 播范围，早治疗防止病情进一步恶化。虽然自1983发现HIV病毒 以来，HIV病毒相关检测指标的研究一直没有停息过，研究从HIV抗体检测到p24抗原检测、 HIV核酸检测以及T淋巴细胞计数等检测项目。但目前在国内的初筛实验依然以HIV抗体 检测为主，窗口期较长容易漏检。目前HIV分为1型和2型，但是国内主要流行HIV-I，而在 HIV-I病毒中，gag基因所编码的结构蛋白是该病毒含量最丰富的蛋白，对于HIV-I颗粒的 组装及释放至关重要且相对稳定不易突变。gag基因全长表达产物P55经蛋白酶水解后成 为P24/P17/P15蛋白，而p24是HIV-I病毒颗粒的主要结构蛋白，在病毒的包装和成熟过程 中起重要作用。P24蛋白的氨基酸序列在HIV-I各毒株之间高度保守，缺失p24会导致病毒 无法正常组装。衣壳蛋白P24特异性很强，与多数其他逆转录病毒无交叉反应，并且HIV-I P24抗体出现较其他抗体早，所以可用于HIV-I感染的早期辅助诊断，但目前的HIV-I P24 抗体检测的试剂盒假阳性率高，特异性低，至今未能得到广泛应用。
技术实现思路
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本专利技术之目的就是提供一种人类免疫缺陷 病毒I型P24抗体检测ELISA试剂盒，可有效解决现有ELISA检测HIV-I抗体的方法检测 窗口期长，易漏检及HIV-I P24抗体检测的试剂盒假阳性率高，特异性低的问题。 本专利技术解决的技术方案是，该试剂盒内设有预包被HIV-I P24抗原酶标板，阴性对 照液血清、阳性对照液血清、辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体（即酶标二抗，购买于生 工生物工程有限公司）、抗体稀释液、显色剂TMB A液和显色剂TMB B液、终止液、洗涤液、 封板膜；其中，阴性对照液血清为正常人血清；阳性对照液血清为含HIV-I P24抗体的人血 清；HIV-I P24抗原为纯化的重组P24蛋白，P24蛋白由以下P24基因序列构成： CN 105158465 A ^ 2/1U 贝 所述的HIV-I P24抗原的制备方法是：选择HIV-I阳性样本，提取RNA反转录为 cDNA ;分别设计三轮引物，其中第一轮引物为： gag_A_ 5, -TCTGGCTGTGTGCCCTTCTTTGCCACAATTGAAACACTT-3， gag_S_ 5, -CGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAG-3， 第二轮引物为： P24_S1 :5' -AGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATG-3， P24_A1 :5, -TTTGTTACTTGGCTCATTGCTTCAG-3' 第三轮引物为： P24_NC0 I -2 :5 ' -TTAACATGCCATGGGCCCTATAGTGCAAAACCT-3 '，其 5 ' 端设计有 NCO I酶切位点； P24_XH0 I -2 :5'-AACCGCTCGAGTGGCAAGATTCTTGCTTTGT-3'，其 5' 端设计有 XHO I酶切位点； 利用上述引物，扩增模板CDNA，扩增后片段大小为693bp，利用omega胶回收试剂 盒切胶回收，得切胶纯化的P24基因片段（P24 DNA)，扩增DH5a-PET32a菌株，得PET32a质 粒，将获得的PET32a质粒和切胶纯化的P24基因片段利用NCO I和XHO I分别双酶切， 酶切后的产物分别用omega胶回收试剂盒进行纯化回收，得酶切PET32a质粒和酶切P24 基因片段；酶切P24基因片段和酶切PET32a质粒连接，构建PET32a-P24重组质粒，提取 PET32a-P24质粒转入BL21菌株中，构成BL21-PET32a-P24菌株，通过IPTG诱导表达P24抗 原，利用镍柱填料初次纯化P24抗原后，再经SDS-PAGE电泳切胶回收再次纯化P24抗原，置 于磷酸盐缓冲液中，透析，经聚乙二醇8000浓缩得浓缩蛋白，即为纯化的重组P24蛋白； 所述的预包被HIV-I P24抗原酶标板的制备方法是： (1)将纯化的重组P24蛋白用碳酸盐包被液稀释至2ug/ml，得稀释液，每孔IOOul 稀释液包被96孔聚苯乙烯微孔板，封膜，4°C，16-18小时； (2)微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS (即磷酸盐缓冲液）洗 涤3次，拍干96孔聚苯乙烯微孔板； (3)封闭微孔板：在96孔聚苯乙烯微孔板的各个孔中加入200ul封闭液，封膜，置 于37°C水浴箱，2h ; (4)微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS洗涤3次，拍干96孔 聚苯乙烯微孔板； (5)预包板的保存：装封闭袋中，置于4°C保存备用； 其中，碳酸盐包被液的配制：碳酸钠（Na2CO3) 0· 8g，碳酸氢钠（NaHCO3) I. 45g，加纯 水溶解后定容至500ml，调PH至9. 6,4°C保存； PBS 的配制：氯化钠（NaCl)8g，氯化钾（KCl)O. 2g，ΚΗ2Ρ04(磷酸二氢钾）0· 24g， Na2HPO4 (磷酸氢二钠）I. 44g，纯水定容至1000ml，调PH至7. 2 ; 封闭液的配制：含5%体积浓度的胎牛血清的PBS ; 所述的检测人类免疫缺陷病毒I型P24抗体检测试剂盒的检测方法： (1)实验设计：根据待测样本的数量选择相应的预包被HIV-I P24抗原酶标板的 微孔数量，另设空白对照、阴性对照、阳性对照各一孔； (2)试剂配制：使用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体，抗体稀 释液和辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体的体积比为1:6000,即得酶标二抗工作液； (3)加样：将待测样本用抗体稀释液按体积比1 :20稀释，每个待测样本的微孔中 待测样本加入量为50ul、阴性对照的微孔中阴性对照液血清加入量为50ul、阳性对照的微 孔中阳性对照液血清加入量为50ul，空白对照的微孔中不加样； (4)温育：用封板膜封盖反应板，置于37°C水浴箱，温育Ih ; (5)洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次， 最后在吸水纸上拍干； (6)加酶：空白对照的微孔除外，其余每孔加入酶标二抗工作液50ul ; (7)温育：用封板膜封盖反应板，置于37°C水浴箱，30min ; (8)洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次， 最后在吸水纸上拍干； (9)加底物液：待测样本的微孔、阴性对照的微孔、阳性对照的微孔和空白对照的 微孔内均加入显色剂TMB A液和显色剂TMB B液各50ul，震荡仪震荡混匀，置于37°C水浴 箱，温育15min ; (10)加终止液：待本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，试剂盒内设有预包被HIV‑1 P24抗原酶标板，阴性对照液血清、阳性对照液血清、辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体、抗体稀释液、显色剂TMB A液和显色剂TMB B液、终止液、洗涤液、封板膜；其中，阴性对照液血清为正常人血清；阳性对照液血清为含P24抗体的人血清；HIV‑1 P24抗原为纯化的重组P24蛋白，P24蛋白由以下P24基因序列SEQ ID NO:1构成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李强，徐立然，王炜，邓博文，李承乘，刘真，何书杰，
申请(专利权)人：河南中医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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