由甜菊苷制备莱苞迪甙A的方法技术

本发明专利技术涉及由蔗糖和甜菊苷通过蔗糖合成酶和糖基转移酶来制备莱苞迪甙A的原位方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术设及一种由薦糖和甜菊巧作为原料通过薦糖合成酶和糖基转移酶来制备 莱巷迪武A的方法。
技术介绍
甜菊是一种高效能甜味剂，甜度为糖的200倍W上，其是经热水提取属于菊科 (Compositae)的甜叶菊（SteviarebaudianaBe;rtoni)而获得的。在甜菊提取物的甜味剂 成分中，已知莱巷迪武A具有较少苦味并且具有与糖最相似的甜味剂品质，并且莱巷迪武A 比糖甜400倍，在非改造的植物的情况下，莱巷迪武A占提取物的约20%左右。在提取物中 最主要的成分是甜菊巧，其是莱巷迪武A的前体。为了生产高纯度莱巷迪武A，有必要对具 有高含量莱巷迪武A的种子、种植、收获、培育管理等进行改进，运会牵设到时间和成本方 面的经济问题。 为了解决运些问题，已经进行了将甜菊巧转化成莱巷迪武A的研究。典型的例子 包括一种方法：利用衍生自±壤微生物的P-1，3-葡聚糖酶，通过酶转化，将葡萄糖分子结 合至甜菊巧，从而将甜菊巧转化成莱巷迪武A(韩国专利公布2004-0026747A和美国专利 6469947)。用于酶转化的糖供体底物的典型例子可W包括凝胶多糖（0-1，3-葡聚糖）。凝 胶多糖是一种高成本的材料，其具有低的溶解度并且缺点在于：其工业应用是困难的。此 夕F，虽然有报道称该凝胶多糖通过真菌发酵将甜菊巧转化成莱巷迪武配糖体，但是微生物 的培养需要花费约15天，并且还会产生其他的甜菊糖巧，如莱巷迪武B等，运使得转化至最 终的莱巷迪武A的转化率仅为40 %左右。
技术实现思路
技术问题 本专利技术的一个目的是克服源自微生物的酶转化中的低产率的限制，提供一种W高 产率制备莱巷迪武A的方法。 本专利技术的另一个目的是提供一种用于制备莱巷迪武A的方法，该方法具有高工业 应用性，因为制备过程简单、节省成本并且耗时较短。 技术方案[000引根据本专利技术的一个方面，提供了一种制备莱巷迪武A的方法，包括： (1)在薦糖合成酶的存在下，使薦糖与二憐酸核巧酸反应，从而制备结合有葡萄糖 的二憐酸核巧酸；W及 (2)在糖基转移酶的存在下，使所述结合有葡萄糖的二憐酸核巧酸与甜菊巧反应， 从而制备莱巷迪武A。 根据本专利技术的另一方面，提供了一种由甜菊巧制备莱巷迪武A的原位方法，包括： 使薦糖、二憐酸核巧酸、甜菊巧、薦糖合成酶W及糖基转移酶反应，从而制备莱巷迪武A。 根据本专利技术的另一方面，提供了通过本专利技术的用于制备莱巷迪武A的方法而制备 的莱巷迪武A。 有益效果 根据本专利技术的制备莱巷迪武A的方法提供高纯度的莱巷迪武A，几乎不产生副产 物，并且产量高。 根据本专利技术的用于制备莱巷迪武A的方法适于大量生产，运是因为，该方法使用 了廉价原料，并且过程简单且耗时较短，因此该方法是经济的。【附图说明】 图1示出了HPLC分析结果，其证明了果糖和结合有葡萄糖的二憐酸尿巧是通过薦 糖合成酶制成的。在图1中，（a)示出了甜菊巧（1)只有在反应时间为0小时是存在的，化） 示出了在反应时间1小时完成之后，结合有葡萄糖的二憐酸尿巧（2)通过薦糖合成酶产生。 图2示出了HPLC分析结果，其证明了：通过糖基转移酶，甜菊巧转化成了莱巷迪武 A。在图2中，（a)示出了甜菊巧（1)只有在反应时间为0小时是存在的，化）示出了甜菊巧 (1)和莱巷迪武A(2)两者在反应时间为0.5小时之后存在，W及（C)示出了在反应时间为 1小时之后，所有甜菊巧（1)被转化为莱巷迪武A(2)。 图3示出了HPLC分析结果，其证明了：莱巷迪武A(2)是由甜菊巧（1)通过薦糖 合成酶和糖基转移酶制备的。在图3中，（a)示出了当甜菊巧底物浓度为IOOmM时，甜菊 巧（1)只有在反应时间为0小时是存在的，化）示出了当甜菊巧底物浓度为IOOmM时，莱巷 迪武A(2)只有在反应时间为24小时之后是存在的，W及（C)示出了当甜菊巧底物浓度为 250mM时，甜菊巧（1)和莱巷迪武A(2)两者在反应时间为24小时之后是存在的。 图4示出了证明用于薦糖合成酶和糖基转移酶的合适的抑评价结果的图表。 图5示出了证明用于薦糖合成酶和糖基转移酶的合适的溫度评价结果的图表。【具体实施方式】 本专利技术的一个实施方案设及一种用于制备莱巷迪武A的方法，包括： (1)在薦糖合成酶的存在下，使薦糖与二憐酸核巧酸反应，从而制备结合有葡萄糖 的二憐酸核巧酸；W及 (2)在糖基转移酶的存在下，使所述结合有葡萄糖的二憐酸核巧酸与甜菊巧 反应，从而制备莱巷迪武A。步骤（1)和步骤似是原位相继（sequentially)或连续 (consecutively)进行的，优选是原位连续进行的。 本专利技术的另一个实施方案设及一种由甜菊巧制备莱巷迪武A的方法，包括：使薦 糖、二憐酸核巧酸、甜菊巧、薦糖合成酶W及糖基转移酶反应，从而制备莱巷迪武A。薦糖、二 憐酸核巧酸、甜菊巧、薦糖合成酶W及糖基转移酶的反应可W是原位进行的。 本文所用的术语"原位"是指反应是在单个反应体系中连续进行的。 在植物糖代谢中，薦糖合成酶通过可逆地将结合至二憐酸核巧酸的葡萄糖转化至 果糖而在薦糖生产中发挥作用。在本专利技术中，薦糖合成酶显示了 ：在抑5至抑10的范围 内使薦糖与二憐酸核巧酸反应，将结合有葡萄糖的二憐酸核巧酸与果糖分开的活性。[化学反应U L/IN丄^心丄04乙<^ A <" ? * O/丄U夕>； 通过糖基转移酶，结合有葡萄糖的二憐酸核巧酸能够与甜菊巧反应，从而制备莱 巷迪武A。 [化学反应引 本专利技术中的化学反应1和2可W在分开的反应器中相继进行，但优选在一个反应 器中连续进行。 在本专利技术中，化学反应1和2可W合并成如下所示的一个反应式： [化学反应引 本专利技术提供了连续反应系统，其中，根据上述化学反应3, 一个葡萄糖特异性地结 合至甜菊巧13-0-葡萄糖的C-3'位置，从而W高产量合成莱巷迪武A。 在本专利技术中，薦糖合成酶可W源自稻米（rice)、玉米（corn)、小麦、竹子、拟南芥 (Ar油idopsisthaliana)、草、大麦化arley)、高梁或马铃馨。优选地，薦糖合成酶是源自 稻米、玉米、小麦或大麦，特别优选源自稻米，尤其是水稻（化yzasativa)。薦糖合成酶可 由利用含有薦糖合成酶基因的载体转化的重组大肠杆菌巧scherichiacoli)、芽抱杆菌 (Bacillus)、酵母、棒状杆菌（Corynebacterium)或±壤杆菌（Agrobacterium)产生。薦糖 合成酶从大肠杆菌巧scherichiacoli)等产生后可W经进一步纯化。薦糖合成酶是本领 域熟知的现有技术。虽然没有特别的限制，但是薦糖合成酶可W包括在SEQIDN0:3中所 不的基本序列。 在本专利技术中，薦糖没有特别限制，只要它可W作为薦糖合成酶的底物向二憐酸核 巧酸提供葡萄糖即可。薦糖的例子可W包括粗糖或糖。 在本专利技术中，嚷岭或喀晚可用作二憐酸核巧酸。优选的是，使用二憐酸尿巧作为二 憐酸核巧酸。 在本专利技术中，在步骤（1)或化学反应1中的反应溫度可W是20°C至60°C，并且反 应抑可W在抑5至抑10的范围内。优选的是，反应溫度为30°C至55°C，反应抑在抑6 至抑9的范围内，特别优选的是，反应溫度为35°C至50°C，并且反应抑在抑7至抑8的 范围内。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备莱苞迪甙A的方法，包括：(1)在蔗糖合成酶的存在下使蔗糖与二磷酸核苷酸反应，从而制备结合有葡萄糖的二磷酸核苷酸；以及(2)在糖基转移酶的存在下，使所述结合有葡萄糖的二磷酸核苷酸与甜菊苷反应，从而制备莱苞迪甙A。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴晟喜，金贞银，尹烂，洪暎镐，金成俌，朴承源，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR