本发明专利技术提供了一种嗜酸乳酸杆菌连续多批次转化红花籽油合成共轭亚油酸(CLA)的方法。它包括如下步骤：(1)吸附载体的制备；(2)嗜酸乳酸杆菌细胞的吸附固定：(3)红花籽油介质液的制备；(4)连续批次转化红花籽油介质液生成共轭亚油酸。本发明专利技术方法连续转化9批次，每次转化率都在70％以上，达到了高密度、多批次转化的目的。本发明专利技术制备工艺简单，反应条件温和，得到的共轭亚油酸异构体单一，为CLA的工业生产提供了一种新的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用嗜酸乳酸杆菌连续多批次转化红花籽油合成共轭亚油酸的方法，属于食品加工
技术介绍
共轭亚油酸是亚油酸具有共轭双键的所有位置和几何异构体的统称，是近年来新发现的一种功能性油脂。医学研究表明，CLA除了具有很强的抗癌功能，还具有降脂减肥、调节人体代谢、降胆固醇、抗动脉粥样硬化，调节血糖、防治糖尿病、提高免疫力、抗氧化、调高骨骼密度和改善睡眠等功能，因此引起国际医学界、营养学界的广泛关注。大多数食物中含有CLA，但是CLA的含量一般都很低，专家建议，每人每天补充共轭亚油酸的量为I?3克较为适宜，这即使在以乳制品和动物性食品为主食的西方国家也难以达到。因此从天然来源中大量分离得到用于保健等用途的CLA难以满足人们的需求，进行人工合成CLA是很好的解决办法。目前生产CLA主要采用化学法，特别是LA的碱法异构化，在工业上被广泛采用。但是化学法得到的产物为一系列具有位置和几何异构体的CLA的混合物，还有环化等副产物存在，分离获得单一异构体非常困难。而微生物法反应条件温和、生成的CLA异构体单一，与天然食物中CLA异构体组成相似，有利于产品的开发应用，逐渐得到人们的重视。近几年来利用微生物静息细胞转化生成CLA为众多研究者所关注，这是由于微生物细胞转化技术操作简单，在反应体系中干扰物质少，不易染菌，更有利于下游的纯化和检测等优点。红花籽油来源广泛，价格比亚油酸低廉，而且是植物油中其亚油酸含量是最高的，约72-85%，这些亚油酸在乳酸菌亚油酸异构酶的作用下可转化生成附加值极高的CLA0李鹏等研究了用游离态的嗜酸乳酸杆菌转化红花籽油，发酵60h，CLA的合成量为94.7yg/mlo对嗜酸乳酸杆菌进行紫外诱变，并进行响应面法优化后，反应36h，，CLA的合成量为311.79 μ g/ml (李鹏，产共轭酸菌株的筛选与发酵条件的优化.大连工业大学硕士学位论文，2010年)。可见，游离态的嗜酸乳酸杆菌转化合成CLA的效率并不高，经过诱导得到的菌株，合成CLA的效率增加了 2倍多。本领域技术人员公知，紫外诱变是随机事件，不一定能保证得到符合目标的高产菌株。菌株固定化可进行高密度、多批次的转化，在工业生产中得到越来越多的重视。李垚等进行了嗜酸乳酸杆菌静息细胞转化菜籽油生成共轭亚油酸的实验研究，通过将嗜酸杆菌进行固定化处理，然后加入生物素将嗜酸乳酸杆菌静息细胞透性化处理，可增加细胞通透性。在该研究中，第一批次CLA产量达255.01 μ g/ml，然而第二、三次产量均有大幅下降，第四次不到150 μ g/ml，第9次仅为120 μ g/ml左右(图5.3)，这表明该嗜乳酸杆菌活性下降太快，仍存在改进的空间(李垚，嗜酸乳杆菌静息细胞转化菜籽油生成共轭亚油酸的研究.南昌大学硕士研究生论文，2013年.)。本领域技术人员公知，微生物的状态，培养基、反应底物的组成，反应条件(温度、PH、含氧量等)等各种因素都会影响微生物的发酵效率、甚至是发酵产物的种类。将嗜酸乳酸杆菌活化后制备种子液、洗涤收集、吸附固定、透性化处理同时转化各类油脂，这中间的每一步都有可能影响最终的转化效率。目前还没有用固定化嗜酸乳酸杆菌静息细胞研究转化红花籽油合成CLA的报道，是否可以得到一个比较满意的转化效率也不得而知。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用乳酸菌静息细胞连续多批次转化红花籽油亚油酸合成共轭亚油酸的方法，解决目前生产共轭亚油酸原料紧缺和生产复杂，效率低，得到的CLA结构不单一以及不能满足社会需求等问题。本专利技术使用的原料红花籽油来源广泛，亚油酸含量丰富，制备工艺温和，操作简单。本专利技术提供了，它包括如下操作步骤:(I)吸附载体的制备；(2)嗜酸乳酸杆菌细胞的吸附固定:(3)红花籽油介质液的制备；(4)连续批次转化红花籽油介质液生成共轭亚油酸:用步骤(2)吸附固定的嗜酸乳酸杆菌细胞转化步骤(3)制备的红花籽油介质液。其中，步骤⑴中，吸附载体的制备方法如下:直径2?4mm的多孔陶粒，先用0.8?1.2mol/L盐酸溶液浸泡12h，再用0.8?1.2mol/L氢氧化钠溶液浸泡10-15h，水洗至中性，烘干备用。多孔陶粒参考鲍腾等的研究方法制备(鲍腾；陈冬；陈天虎等.铁氧化物生物多孔陶粒的制备工艺及性能，复合材料学报，2014年第2期.)。优选地，盐酸溶液的浓度为lmol/L，氢氧化钠溶液的浓度为lmol/L，氢氧化钠溶液的浸泡时间为12h。其中，步骤⑵中，嗜酸乳酸杆菌细胞的吸附固定方法如下:嗜酸乳酸杆菌种子液按5%接种量接种至亚油酸含量为0.2mg/mL MRS液体培养基中进行增殖诱导培养，37°C下静置培养20?24h ;培养液冷冻离心，离心条件为4000?5000rpm、20?30min、4°C;去上清液，沉淀嗜酸乳酸杆菌细胞用无菌生理盐水洗涤2?3次，离心收集嗜酸乳酸杆菌细胞。将装有多孔陶粒的反应容器灭菌后，加入离心收集到的嗜酸乳酸杆菌细胞，嗜酸乳酸杆菌细胞的湿重与多孔陶粒干重的比值为(I?1.5): (10?15);然后加入多孔陶粒重量I?1.5倍的生理盐水浸没载体和嗜酸乳酸杆菌细胞；反应容器置于4°C，静置吸附2.5小时，4°C、4000?5000rpm、离心5?lOmin，弃上清液，沉淀物即为吸附固化的嗜酸乳酸杆菌细胞。优选地，嗜酸乳酸杆菌的种子液由以下方法制备:从新鲜斜面挑取活化的嗜酸乳酸杆菌接到MRS液体培养基中，37 0C，静置培养24?30h，得种子液。优选地，每升MRS液体培养基中，各组分的用量为:酪蛋白胨10.0?15.0g、牛肉浸膏8.0?12.0g、酵母提取物3.0-6.0g、葡萄糖10.0?15.0g、乙酸钠4.0?6.0g、梓檬酸二胺1.0?3.0g、吐温-80 0.8?1.2g、磷酸氢二钾1.0?3.0g、硫酸镁0.1?0.3g、硫酸锰0.03?0.06g，余量为水。称取前述各组分，置于2000ml烧杯内，加双蒸水至1000ml，加热，搅拌，直至各组分完全溶解，磷酸钠缓冲溶液调节pH 6.3?6.8，121°C高压湿热灭菌20-30min，即得MRS液体培养基。优选地，种子液接种量为5 %，种子液接种至亚油酸含量为0.12mg/mL MRS液体培养基中进行增殖诱导培养；培养液冷冻离心的转速是4000rpm，离心时间是24min。优选地，嗜酸乳酸杆菌细胞的湿重与多孔陶粒干重的比值为12: 125;生理盐水用量为多孔陶粒等重量；吸附后的离心转速为4000rpm，离心时间为7min。进一步优选地，种子液制备过程中，静置培养时间为27h。进一步优选地，每升MRS液体培养基中，各组分的用量为:酪蛋白胨12.0g、牛肉浸膏10.0g、酵母提取物4.5g、葡萄糖12.0g、乙酸钠5.0g、梓檬酸二胺2.0g、吐温-80 1.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g，余量为水。称取前述各组分，置于2000ml烧杯内，加双蒸水至1000ml，加热，搅拌至各组分完全溶解，磷酸钠缓冲溶液调节pH 6.5，121°C高压湿热灭菌25min，即得MRS液体培养基。其中，步骤(3)中，红花籽油介质液由如下步骤当前第1页1 2 3 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种嗜酸乳酸杆菌连续多批次转化红花籽油合成共轭亚油酸的方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：(1)吸附载体的制备；(2)嗜酸乳酸杆菌细胞的吸附固定：(3)红花籽油介质液的制备；(4)连续批次转化红花籽油介质液生成共轭亚油酸：用步骤(2)吸附固定的嗜酸乳酸杆菌细胞转化步骤(3)制备的红花籽油介质液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁晨旭，张秋龙，刘斌，马涛，胡娜，索有瑞，
申请(专利权)人：中国科学院西北高原生物研究所，
类型：发明
国别省市：青海;63
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