一种胚胎干细胞分化间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术公开一种胚胎干细胞(ESC)分化间充质干细胞(MSC)的方法，包括以下步骤：(1)、将ESC培养至部分ESC趋向分化状态，得到成纤维状细胞；(2)、消化步骤(1)中ESC，剩余依旧贴附的成纤维状细胞；(3)、将步骤(2)剩余的成纤维状细胞扩增培养；(4)、消化步骤(3)中的成纤维状细胞，转移至黏附细胞培养瓶中培养得到MSC。本诱导途径不用经过胚体(EB)培养过程，直接从ESC转化为MSC，更为简便；与直接用胰酶消化ESC再接种至MSC培养条件相比较，MSC诱导效率更高，诱导成功所需的时间更短。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种通过诱导胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESC)生成间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell.MSC)的方法。
技术介绍
间充质干细胞(MSC)是干细胞家族的重要成员，是一类具有自我复制和多向分化能力的多潜能细胞。该类干细胞能维持未分化的状态并进行大量复制扩增，亦能在一定条件下进行多系分化，形成下游的特定组织类型细胞，分化的组织类型多数为中胚层来源的组织类型，如骨、软骨和脂肪等。其来源于发育早期的中胚层和外胚层，最初在骨髓中发现，后来在脐带、胎盘、脂肪和肌肉等组织中发现。目前研究表明MSC不但具备可扩增性、多向分化能力和低免疫原性，而且可以调控免疫反应和具有旁分泌功能，因此具有再生各种组织器官的强大潜力，并且对于多种免疫性和全身性疾病有治疗作用。但因组织来源复杂，对细胞的质控需要耗费大量的时间和金钱，对于急性病、重症病、先天性疾病和肿瘤患者来说取自身的细胞进行治疗不可行，并且MSC随着体外扩增迅速衰老，在第14代左右增殖和分化能力均显著下降，从单个个体获得治疗量的MSC难度大，因此建立其他来源的MSC库犹为重要。胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC。)来源于囊胚期胚胎内细胞团，是一类全能干细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ESC都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。因ESC直接移植容易形成畸胎瘤，所以若将其运用于再生医学中的替代治疗，需要在一定分化条件下，在体外将ESC定向诱导成所需细胞或者前体细胞类型。由于其具有无限增殖能力，非常适宜作为建立MSC库的细胞来源。现有从ESC诱导成MSC的方法有很多，但是主要存在诱导过程复杂、诱导时间长、诱导效率不尚等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，其可以解决现有技术的诱导过程复杂、诱导时间长、诱导效率不高的缺点。本专利技术建立一个简便、实用、有效且稳定的分化方法，从ESC诱导出大量MSC，为MSC治疗提供足量、稳定、质优的细胞源打下基础。本专利技术采用以下技术方案:—种胚胎干细胞分化间充质干细胞的方法，，包括以下步骤:(I)、将ESC培养至部分ESC趋向分化状态，得到成纤维状细胞；(2)、消化步骤(I)中ESC，剩余成纤维状细胞；(3)、将步骤(2)剩余的成纤维状细胞扩增培养；(4)、消化步骤(3)中的成纤维状细胞，转移至黏附细胞培养瓶中培养得到MSC。所述步骤(I)中，ESC培养在基质胶上，用ESC培养基维持培养，培养基的换液时间延长至ESC营养不良趋向分化，呈现成纤维状细胞。所述步骤(2)中用0.02% EDTA消化ESC。所述0.02% EDTA消化ESC的温度为25 °C、时间为7分钟。所述步骤(2)中ESC经EDTA消化后，用PBS缓冲液吹洗掉经EDTA消化分离的ESC。所述步骤(3)中扩增依旧贴附的成纤维状细胞至融合率大于90%。所述步骤(3)中扩增成纤维状细胞的培养基为MSC培养基。所述步骤(4)中，消化步骤(3)中的成纤维状细胞的条件为胰酶消化，温度为37°C，时间为2分钟，消化完成后用与胰酶等量的MSC培养基停止胰酶的消化作用，使细胞完全脱落，收集细胞并进行离心，离心后弃上清液，用MSC培养基重悬细胞，并接种至细胞培养瓶中，24小时后换液，贴壁的细胞为MSC。所述MSC培养基包括L-DMEM基础培养基和10 %胎牛血清。本专利技术的优点是:本诱导途径不用经过胚体(EB)培养过程，不用保持良好未分化状态的ESC进行诱导，而是用状态不好、按正常ESC传代操作程序应丢弃的细胞直接转化为MSC,更为简便；与直接用胰酶消化ESC再接种至MSC培养条件相比较，MSC诱导效率更高；运用的是Η)ΤΑ消化后剩下依旧贴附的细胞进行诱导，原消化后的ESC可继续进行传代或保种，充分利用了 ESC。【附图说明】图1是本专利技术ESC细胞照片。图2是本专利技术的周边部分分化的纤维状细胞照片。图3是本专利技术的由ESC诱导分化成功的MSC细胞照片。图4A至图4C是本专利技术的MSC marker的鉴定图。【具体实施方式】下面结合附图进一步阐述本专利技术的【具体实施方式】:—种胚胎干细胞分化间充质干细胞的方法，包括以下步骤:(I)、将ESC培养至部分ESC趋向分化状态，得到成纤维状细胞；(2)、消化步骤(I)中ESC，剩余依旧贴附的纤维状细胞；(3)、将步骤⑵剩余贴附的成纤维状细胞扩增培养； (4)、消化步骤(3)中的成纤维状细胞，转移至黏附细胞培养瓶中培养得到MSC。步骤(I)中ESC示例图为WAOl-Fl (购自WiCell公司的细胞株)培养在matrigel上(购自BD公司)，用mTeSRl?l (购自STEMCELL TECHNOLOGIES公司)维持培养，如图1所示。延长换液时间，更换新鲜培养基mTeSRl的频率减少为为四天一次，导致部分ESC趋向分化呈现成纤维状细胞，如图2所示。所述步骤(2)中，消化ESC样细胞用0.02% EDTA(购自Sigma公司)，消化ESC的条件为常温(25°C ) 7分钟。消化后用PBS缓冲液(成分:NaCl8g/L，KCl 0.2g/L,Na2HPO4L 44g/L,KH2PO40.24g/L,pH 7.4)吹打掉经EDTA消化分离的 ESC，剩下成纤维状细胞依旧贴附在matrigel上。所述步骤(3)中，将剩下的贴附的成纤维状细胞换上新鲜的MSC培养基:L-DMEM+10% FBS (胎牛血清)(均购自Gibco公司)。每3天更换一次新鲜的培养液，以扩增细胞达到90%融合率。所述步骤(4)中，用适量胰酶(购自Gibco公司)消化90%融合的成纤维状细胞，消化的条件为37°C，时间2分钟。之后用与胰酶等量的MSC培养基:L-DMEM+10% FBS (均购自Gibco公司)停止胰酶的消化作用。吹打细胞培养皿(购自Corning公司)底面，使细胞完全脱落，集中收集到15ml离心管(购自Corning公司)中进行离心，离心转速为200Xg，离心时间为5分钟。离心后弃上清液，用14mlMSC培养基:L_DMEM+10% FBS (均购自Gibco公司)重悬细胞，并接种至新的T75细胞培养瓶(购自Corning公司)中，24小时后换液，贴壁的细胞即认为它是第O代的MSC。本专利技术还包括ESC-MSC的MSC表面marker的鉴定:分别取5X105的ESC-MSC细胞进行抗体CD90-F1TC，CD73-PE，CD105_PE(均购自MACS公司)的孵育(孵育条件:冰上，15分钟)，抗体体积为细胞量体积的1/10 ;孵育完毕，用ImlPBS进行清洗，离心(300 X g，5min)，用500ul的1%多聚甲醛固定，以备流式检测用，同时取5X105ESC_MSC直接用500ul的1%多聚甲醛固定，作为阴性对照结果表明所诱导的细胞的确表达MSC的表面标志物，如图4A至图4C所示。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例而已，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。【主权项】1.，其特征在于，包括以下步骤: (1)、将ESC培养至部分ESC趋向分化状态，得到成纤维状细胞；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胚胎干细胞分化间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、将ESC培养至部分ESC趋向分化状态，得到成纤维状细胞；(2)、消化步骤(1)中ESC，剩余依旧贴附的成纤维状细胞；(3)、将步骤(2)剩余的成纤维状细胞扩增培养；(4)、消化步骤(3)中的成纤维状细胞，转移至黏附细胞培养瓶中培养得到MSC。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：柳华，王亚菲，蒋诗漫，欧阳阳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33