一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法技术

本发明专利技术公开了一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法，本发明专利技术利用沿阶草EMS体细胞诱变结合体细胞胚再生可实现短时间内获得大量多种多样的同质突变体，避免嵌合体的形成，容易产生表型可见并且遗传稳定的同质突变体库。所以此项发明专利技术不但在短时间内可快速地构建起沿阶草EMS同质突变体库，而且有利于今后沿阶草功能基因组学、遗传育种与生理发育等问题系统深入的研究，同时也为选育沿阶草新品种提供了最直接有效的突变体材料，具有重要的理论意义和应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物育种领域，特别涉及一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法。
技术介绍
沿阶草又名麦冬(Oph1pogon bodinieri)，是我国特有的观叶地被植物，属百合科沿阶草属中沿阶草种多年生常绿草本植物，因其植株低矮，耐荫性强，抗病抗虫性好，终生免修剪等特性，而作为许多地方理想的观叶地被植物或园林绿化中的构景植物；沿阶草还具有药用性，其块根，常为滋阴中药，《神农本草经》列为上品，还是“药食同源”品种，在保健食品的开发方面也有大量的应用。沿阶草作为我国特有的一种重要的无性繁殖植物，不但品种改良近年来不断得到重视，其特有的一些生物学性状如强耐荫性和药效好等也使得它成为寻找某些有重要利用价值的基因如耐荫基因、药用性好等基因资源发掘利用的典型材料。分析鉴定基因的功能及基因之间的相互作用，基因对生长发育的影响，是功能基因组学的重点研究内容。目前尽管已经开发出了多种分析鉴定基因的新技术新方法，但最直接最有效的方法是构建饱和基因突变体库，通过突变体分析鉴定基因的功能。所以突变体库的构建是功能基因组学的研究基础。目前模式植物拟南芥、水稻等作物均已构建了饱和突变体库并进行了相关功能基因组学的研究，获得了一批有重要价值的创新种质资源。突变体库的构建类型:按照生物产生突变体的过程分为:自发突变体库(大约只有万分之一以上的生殖细胞会发生突变，所以突变频率很低)；理化诱变突变体库(受限于个体和器官组织水平的再生，而导致诱变后代中嵌合体现象很严重，同质突变频率很低)；和插入突变体库(易受受体材料及组培方法的影响而导致转化效率不高)等。其中，利用理化诱导剂获得突变体是目前许多植物构建突变体库的主要方法。主要原因是其操作简便，产生的突变可随机分布于整个基因组、密度高，成本低，特别适宜于饱和突变体库的仓Ij制，而且所获得的突变体不涉及转基因事件，所以安全性高、便于应用。在众多的化学诱变剂中，甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulphonate，EMS)因其可在一个基因组上产生多个点突变，且分布均匀，有利于等位基因突变体的获得，特别是较小的突变群体便可获得饱和的突变体库而成为应用最广泛，即高效又稳定的一种化学诱变剂。同质突变体的获得:最快速有效的方法就是通过单个突变细胞的组培再生获得。由同质突变体获得的变异性状由于突变体无嵌合现象，所以是能够稳定遗传的，是组成同质突变体库的基础。但如何使一个单细胞发育成一棵完整植株，一直是许多植物组培再生的难题。目前的研究表明绝大多数植物体细胞胚起源于单细胞，体细胞胚胎发生途径重演了合子胚形态发生的过程，所以体细胞胚再生途径是再生种子来源、种苗脱毒快繁、诱导体细胞变异或基因转化的理想的受体系统。长期以来大部分植物组培再生都不是依赖于细胞水平上的再生，而是局限于个体或器官组织水平的再生。由多细胞组织器官诱变产生的再生植株后代，因其众多细胞基因突变的差异性往往导致突变体嵌合现象很严重，性状不稳定、重复性差、再生筛选时间延长，同质突变体频率很低、由于很难获得同质突变体，从而导致育种效率下降等一系列弊端。研究表明:体细胞诱变、体细胞胚再生是快速获得广泛变异的同质突变体、避免嵌合体形成的理想方法，很容易在短时间内获得大量的多性状的同质突变体，产生表型可见并且遗传稳定的突变体库。所以体细胞化学诱变技术结合体细胞胚再生技术，是保证快速获得EMS同质突变体库的关键技术。目前国内外尚未发现利用遗传背景相同的细叶沿阶草体细胞通过EMS诱变处理，体细胞胚再生植株构建具有丰富变异材料的饱和同质突变体库的方法报道。因此本专利技术突破了以往大多数植物:1)尽管以化学诱变方法创制了突变体，但构建突变体库的亲本材料的遗传背景不相同；2)尽管以化学诱变方法创制了突变体，但突变体大多是以个体或器官组织发生途径再生的植株，从而导致突变体嵌合现象非常严重；3)由于突变体嵌合现象很严重，所以产生的性状很不稳定，延长了再生筛选时间，很难快速获得同质突变体，也就难以快速构建起遗传稳定的变异丰富的饱和同质突变体库。本项专利技术提供的一种快速构建沿阶草EMS饱和同质突变体库的方法，不但有利于沿阶草功能基因组学、遗传育种与生理发育等问题进行系统深入研究，同时也为选育沿阶草新品种提供了最直接有效的突变体材料，具有重要的实用价值。
技术实现思路
专利技术目的:针对现有技术的不足，本专利技术主要解决的问题是提供一种体细胞EMS诱变与体细胞胚再生相结合，快速构建沿阶草EMS饱和同质突变体库的一种优化方法。技术方案:为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法，该方法包括如下步骤:I)高频体细胞胚外植体材料准备:选取室外健康无病虫害的沿阶草植株，取其幼嫩茎叶并带3-4片幼叶，无菌消毒后在无菌培养基中组培成无菌试管苗，取其茎叶基部0.5-1.0cm大小外植体，通过高频体胚再生系统的培养，就会持续不断地产生体细胞胚和胚状体及完整地再生植株，以再生植株作为高频体细胞胚外植体材料来源；2)早期体细胞胚外植体的培养:将上述具高频体细胞胚再生能力的外植体切取其叶、茎基部0.5cm大小组织块，放在体胚发生诱导培养基上25-28°C无菌室暗培养7_10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚，以此作为诱变剂处理材料；3)化学诱变剂准备:包括不同浓度甲基磺酸乙酯(EMS)溶液准备；4)早期体细胞胚外植体的HMS处理:将早期体细胞胚外植体先分成6个大组，每个大组再分成3份，6个大组用于6个不同浓度的EMS诱变剂的处理；每个大组分成的3份分别用于3个不同浸泡时间的处理；EMS溶液浸泡处理时间分为:1.0小时、1.5小时和2.0小时；5)体细胞胚分化培养:将经EMS诱变处理过的早期体细胞胚外植体，重新接种于体胚发生诱导培养基继续在温度为25-28°C无菌室暗培养至50-60d，中间继代一次，有利于体细胞胚分化，可见外植体上大大小小生长发育出几十个早期突变胚状体；6)突变胚状体快繁増殖培养:将上述早期突变胚状体切成0.5cm大小块，分别编号转接于体细胞胚快繁增殖培养基，放在25-28°C光下培养50-60d，中间继代一次，可获得大量成熟的突变胚状体；7)成熟突变胚状体再生植株:将成熟突变胚状体转接于植株再生培养基中，在无菌室温度25-28°C光下培养20-25d，获得具根、茎、叶完整的再生植株；8)突变体再生植株炼苗移栽:当根长生长到1-1.5cm时，将各突变体株系分别编号移栽到花盆，选择轻型基质，放置在温室大棚内，自动间歇喷雾装置浇水；成活率可达100%。揭去培养瓶的封口膜，在室内炼苗I?2d，用镊子小心取出小苗，洗净根上附着的培养基，移栽到装有轻型基质(泥炭:蛭石=1:1)的花盆中，放入温室温度为24°C?26°C，适当遮荫，或将小苗放到苗床下，自动间歇喷雾装置浇水。9)田间突变体库建立:60d后选择温暖湿润阴天将各个突变体株系移栽到室外林下或田间区试圃，分别编号，记载相关性状，在突变体生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选，以此建立起沿阶草理化饱和突变体库，用于后续沿阶草选择育种和基因功能组学等方面的研究。由于小苗生长旺盛，对移栽大田的条件要求也不高，极易种植，小苗的成活率可达 100%。其中，所述EMS溶液配制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1) 高频体细胞胚外植体材料准备：选取室外健康无病虫害的沿阶草植株，取其幼嫩茎叶，无菌消毒后在无菌培养基中组培成无菌试管苗，取其茎叶基部0.5‑1.0cm大小外植体，通过高频体胚再生系统的培养，就会持续不断地产生体细胞胚和胚状体及完整地再生植株，以再生植株作为高频体细胞胚外植体材料来源；2)早期体细胞胚外植体的培养：将上述具高频体细胞胚再生能力的外植体切取其叶、茎基部0.5cm大小组织块，放在体胚发生诱导培养基上25‑28℃无菌室暗培养7‑10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚，以此作为诱变剂处理材料；3) 化学诱变剂准备：包括不同浓度甲基磺酸乙酯(EMS)溶液准备；4) 早期体细胞胚外植体的EMS处理：将早期体细胞胚外植体先分成6个大组，每个大组再分成3份，6个大组用于6个不同浓度的EMS诱变剂的处理；每个大组分成的3份分别用于3个不同浸泡时间的处理；EMS溶液浸泡处理时间分为：1.0小时、1.5小时和2.0小时；5) 体细胞胚分化培养：将经EMS诱变处理过的早期体细胞胚外植体，重新接种于体胚发生诱导培养基继续在温度为25‑28℃无菌室暗培养至50‑60d，中间继代一次，有利于体细胞胚分化，可见外植体上大大小小生长发育出几十个早期突变胚状体；6) 突变胚状体快繁増殖培养：将上述早期突变胚状体切成0.5cm大小块，分别编号转接于体细胞胚快繁增殖培养基，放在25‑28℃光下培养50‑60d，中间继代一次，可获得大量成熟的突变胚状体；7) 成熟突变胚状体再生植株：将成熟突变胚状体转接于植株再生培养基中，在无菌室温度25‑28℃光下培养20‑25d，获得具根、茎、叶完整的再生植株；8) 突变体再生植株炼苗移栽：当根长生长到1‑1.5cm时，将各突变体株系分别编号移栽到花盆，选择轻型基质，放置在温室大棚内，自动间歇喷雾装置浇水；9) 田间突变体库建立：60d后选择温暖湿润阴天将各个突变体株系移栽到室外林下或田间区试圃，分别编号，记载相关性状，在突变体生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选，以此建立起沿阶草理化饱和突变体库。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁慧敏，刘南清，丁久玲，刘艳，刘进华，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32