本发明专利技术属于植物分子生物学技术领域，具体涉及一种控制水稻叶片颜色的蛋白及其编码基因与应用。所述控制水稻叶片颜色的水稻ZL9蛋白，其序列如SEQ ID №.2所示。本发明专利技术还公开了水稻ZL9的基因以及该基因在制备叶色加深、光合效率提高的转基因细胞系及转基因植株中的应用。本发明专利技术利用图位克隆策略获得该基因ZL9。利用基因工程方法改变该基因的表达量，既可以培育水稻斑马叶新种质，在杂交育种中作为标记性状；又可以培育叶绿素含量高于野生型的新材料，提高光和效率。因此，利用该基因在高产水稻的培育方面具有重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物分子生物学
，具体涉及一个控制水稻叶片颜色的蛋白及 其编码基因与应用。
技术介绍
叶片是水稻最主要的光合作用器官。叶片光合作用强弱会直接影响水稻产量的高 低。本研究在以粳稻中花11为背景的突变体库中筛选到一个斑马叶突变体（zebra leaf 9，zl9)。采用图位克隆策略，克隆了 ZL9基因，获得了该基因的编码序列。该基因的克隆和 功能分析在水稻中是首次报道，为人们理解水稻叶绿体发育和叶绿素代谢调控机制进而用 于指导育种奠定了重要基础。 基因L0C-0s09g28480在NCBI网站上的注释为：保守的假设蛋白，通过水稻全基 因组数据库搜索，表明ZL9基因为单拷贝基因。基因序列全长4578bp，cDNA为618bp，编码 205个氨基酸。该基因在拟南芥中的同源基因CY01编码一个二硫键异构酶，它具有C4型 锌指结构域，与大肠杆菌DnaJ结构相似，CY01蛋白定位在叶绿体类囊体膜上。CY01可能是 在子叶叶绿体发育过程中从GSH(glutathione,谷胱甘肽）接收电子，并且通过不断地打开 和闭合二硫键来加速含半胱氨酸的PSI亚基（A1、A2和psaK)和PSII亚基（CP43和CP47) 的折叠，是子叶中的类囊体膜生物合成所必需的。 将ZL9基因蛋白与高梁、玉米、短柄草、大麦、葡萄、蓖麻、黄瓜、桃、大豆、番茄、拟 南芥、草莓和苜蓿的同源蛋白进行氨基酸序列比对分析，结果显示，不同生物的该基因有很 强的保守性，ZL9与单子叶植物有较高的同源性。与高梁、玉米、短柄草、大麦的相似性分别 为86. 7%、84. 2%、80. 6%和78. 2%，与双子叶植物的相似性较低，仅有45% -54%，与拟南 芥、番茄、黄瓜的相似性分别为51. 5%、53. 9%和46. 1%。DNAMAN软件最大似然数法进行的 系统发生树分析也表明：ZL9基因与同是禾本科植物的高粱、玉米比其他生物有更密切的 未缘关系。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种水稻ZL9蛋白及其编码基因和应用。 本专利技术提供的水稻ZL9,来源于水稻，是如下1)或2)的蛋白质： 1)由序列表中的SEQ ID N2 . 2的氨基酸残基序列组成的蛋白质； 2)将序列表中的SEQ ID N2. 2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取 代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID N2 . 2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。 序列表中序列2由205个氨基酸残基组成。 为了便于ZL9的纯化，可在由序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基端或 羧基端连接上如表1所示的标签。 表1标签的序列 上述2)中的ZL9可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上 述2)中的ZL9的编码基因可通过将序列表中序列1示的DNA序列中缺失一个或几个氨基 酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3' 端连上表1所示的标签的编码序列得到。 编码上述水稻ZL9的基因也属于本专利技术的保护范围。 所述水稻ZL9蛋白cDNA基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子： 1)序列表中SEQ ID N2 ? 1的DNA序列； 2)编码序列表中SEQ ID N2 . 2蛋白质序列的多核苷酸； 3)与序列表中SEQ ID N2. 1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功 能蛋白质的DNA序列； 4)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 序列表中的序列1由618个碱基组成，其开放阅读框架（0RF)为自5'末端第 1-618位核苷酸。 上述严格条件可为在0. 1XSSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C条件 下杂交并洗膜。 含有以上任一所述基因的重组载体也属于本专利技术的保护范围，如重组表达载体。 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体（如pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、 PCAMBIA3301、pCAMBIA1301-UbiN、pCAMBIA1300等）和可用于植物微弹轰击的载体等。所 述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参 与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体 的3'端，如农杆菌冠癭瘤诱导（Ti)质粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大 豆贮存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具有类似功能。 使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种 增强型启动子、组成型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV)35S启动子、玉米 的泛素启动子（Ubiquitin)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植 物启动子结合使用；此外，使用本专利技术的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括 翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子 等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起 始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起 始区域或结构基因。 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、 萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是 抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选 择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。 含有以上任一所述基因（ZL9)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本专利技术的 保护范围。 扩增上述基因的全长或任一片段的引物对也属于本专利技术的保护范围之内。 所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任 意一种均可应用于培育"斑马叶"表型的水稻。 利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导 入植物细胞，可获得叶色加深，光合效率提高的转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基 因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、 农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。 本专利技术在突变体库中筛选到一个水稻斑马叶突变体zl9,该突变体材料来源于中 花11，移栽伤根条件下，新长出的2-3张叶片间断失绿，即横向的"斑马纹";不移栽时，突变 体没有突变表型出现。本专利技术利用突变体zl9与南京11杂交匕代，将ZL9基因初步定位到 第9号染色体上；进一步扩大群体，定位到一个L0C-0s09g2848基因。它是一个保守的假设 蛋白，在NCBI网站上无其它注解，通过水稻全基因组数据库搜索，表明ZL9基因为单拷贝基 因。基因克隆后，不仅对了解水稻叶绿体发育和叶绿素代谢调控机制具有重要的理论价值， 同时，也可探索直接将其运用于水稻育种。本专利技术获得了水稻ZL9基因，利用基因工程方法 改变该基因的表达量，既可以用于培育水稻斑马叶新种质当前第1页1&n本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种控制水稻叶片颜色的水稻ZL9蛋白，其特征在于，是如下1)或2)的蛋白质：1)由SEQ ID №.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将SEQ ID №.2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №.2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：严长杰，郭旻，杨海莲，刘敏，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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