一种荧光探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种荧光探针及其制备方法与应用，其结构式如下式Ⅰ所示：荧光探针的制备方法，包括如下步骤：将对硝基苯甲醛，2,5-二甲基吡嗪和催化剂混合得到混合液，将混合液加热至150-180℃，反应，得到PY-NO2；在PY-NO2中加入多硫化钠，反应，得到PY-NH2；将PY-NH2、咖啡酸、三乙胺、HOBT和EDC.HCL加入到二氯甲烷和DMF的混合溶剂中得到混合液；所述混合液在惰性气体的保护下，搅拌，得到双光子荧光探针的粗产品，纯化后，得到双光子荧光探针纯品。本发明专利技术的荧光探针的化学稳定性，光物理稳定性好；在酸性、中性和碱性中对O2˙-都能响应敏感，测定灵敏度较高，且响应时间极短。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，具体设及一种巧光探针及其制备方法与应用。
技术介绍
有机体寿命受多重复杂因素的影响，例如细胞机制和环境。大量证据表明细胞能 量代谢与ROS密切相关。然而，到目前为止，关于ROS的作用方面还没有一致的观点。许多 研究发现ROS参与到细胞损伤中因此加速老化过程。但是，也有许多人发现ROS信号转导 的作用会延缓与老化相关的疾病或者是老化本身。运些争议存在是由缺少理想的工具用于 精确监测生物体系中ROS变化的困难引起的。考虑到〇2 是第一个产生的ROS而且能够 转化成其他R0S，灵敏、瞬时的在活体中示踪化?对于理清〇2'与寿命的关系有着重要作 用。巧光成像的检测方法提供了高的时空分辨率，同时对细胞损伤小，所W越来越多的被认 为是一种检测生物活性小分子的有力工具。然而具有更好的光学性能的用于可视化活体中 〇2 的巧光探针仍然非常缺少。 双光子巧光显微镜（TPFM)在活体成像领域有着广泛的应用前景，其中包括生物 传感，肿瘤学，神经科学W及胚胎学，因为TPFM应用了两个能量更低的光子激发从而增加 了组织的穿透深度和减少了光损伤。因此，大量的TP巧光探针被成功的应用于检测活细胞 和活体中的生物活性小分子。为了研究复杂环境中化水平对有机体寿命的影响，迫切需 要建构能够动态成像〇2'变化的TP巧光探针，同时该探针还需要具有良好的选择性，高的 TP吸收截面积W及深的穿透深度。但是，目前满足要求的用于可视化活组织和完整有机体 中〇2 的TP巧光探针仍然非常缺少。因此为了解决上述问题，新的成像0 2'巧光探针的 光学性能需要大大提高。【
技术实现思路
】 针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种巧光探针及其制备方法与应用，该 巧光探针具有灵敏度、选择性好W及光稳定性好的优点。 阳〇化]为实现上述目的，本专利技术的技术方案为： 一种巧光探针，其结构式如下式I所示： 上述巧光探针的制备方法，包括如下步骤： DPY-N02 (2, 5-二（4,-硝基苯乙締基）化嗦）的制备： 将对硝基苯甲醒，2, 5-二甲基化嗦和催化剂混合得到混合液，将混合液加热至 150-180°C，反应，得到PY-N02 ; W11] 。2, 5-二（4'-氨基苯乙締基）化嗦（PY-N肥）的制备： 阳01引在步骤1)得到的PY-N02中加入多硫化钢，反应，得到PY-NH2 ; 3)巧光探针的制备： 将PY-N肥、咖啡酸、S乙胺、1-径基苯并S挫化0BT)和1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基）碳酷二亚胺盐酸盐巧DC.肥L)加入到二氯甲烧和DMF的混合溶剂中得到混合液；所 述混合液在惰性气体的保护下，揽拌，得到巧光探针的粗产品，纯化后，得到巧光探针纯品。 优选的，步骤1)中，所述2, 5-二甲基化嗦、对硝基苯甲醒和催化剂=者的物质的 量之比为 1 :(1-2. 5) :(1-2. 5)。 进一步优选的，所述2, 5-二甲基化嗦、对硝基苯甲醒和催化剂=者的物质的量之 比为1 :2 :2。 优选的，步骤1)中，所述催化剂为邻苯二甲酸酢、苯甲酸酢或乙酸酢。运些催化剂 不但可W有效地提高2, 5-二甲基化嗦和对硝基苯甲醒的反应速率，还可W有效提高原料 的转化率。 优选的，步骤1)中，所述混合液是在加热回流的条件下反应的，回流的时间为 IO-ISho 优选的，步骤1)中，所述PY-N02的纯化方法，包括如下步骤：将步骤1)中反应得 到的PY-N02粗产品用氯仿或二氯甲烧溶解，洗去PY-N02粗产品中的催化剂后，有机层通过 硅胶柱色谱分离后，得到PY-N02纯品。 进一步优选的，洗去PY-N02粗产品中催化剂的溶液为饱和氨氧化钢溶液、饱和碳 酸钢溶液或饱和氨氧化钟溶液。运些饱和溶液可W彻底地除去PY-N02粗产品中的催化剂， 使得到的PY-N02更纯净。 阳〇2U 优选的，步骤2)中，PY-N02与多硫化钢的物质的量之比为1 :1-1 :10。 优选的，步骤2)中，PY-N02与多硫化钢的混合物在95%的乙醇溶液中回流3-化， 回流溫度为78°C，制得PY-N肥。95%的乙醇溶液的沸点为78°C，可W保证在加热反应的过 程中，反应物的溫度维持在78°C，既保证了反应速率，又减少了反应产生的副产物。 阳02引优选的，步骤扣中，所述PY-N肥，咖啡酸，立乙胺，册BT和邸C.肥L五者的物质的 量比为1: (2-3. 5) : (2-3. 5) : (2-3. 5) : (2-3. 5)。其中，H0BT、邸C.肥L是反应催化剂，作用 是活化咖啡酸的簇基。 优选的，步骤3)中，PY-N肥和混合溶剂的比例为Immol: (8-30)ml。 优选的，步骤3)中，所述混合溶剂中，DMF和CH2CI2的体积比为1 :2-6。该组分配 比的混合溶剂可W充分溶解反应物，使反应顺利进行。 优选的，步骤3)中，巧光探针粗产品的纯化方法，包括如下步骤：将得到的粗产品 进行浓缩，将浓缩后的粗产品进行薄层色谱分离，洗脱剂为甲醇、甲苯和乙酸乙醋混合液， 其中，甲醇、甲苯和乙酸乙醋的体积比为1 :6-10 :2-6。该洗脱剂可W有效地将巧光探针洗 脱下来，而不会将其他杂质洗脱下来，而且运种洗脱剂易与产物分离，保证了洗脱后的产品 的纯度。 进一步优选的，所述洗脱剂中甲醇、甲苯和乙酸乙醋的体积比为1 :8 :4。 本专利技术的巧光探针，单光子激发波长为400nm，双光子激发波长为800nm，最大发 射波长为520皿。 上述的巧光探针在检测细胞内或活体内的超氧阴离子中的应用。 上述的巧光探针检测细胞或活体内超氧阴离子的方法为：用含有巧光探针的溶 液解育细胞或活体，解育设定时间后，洗去多余巧光探针分子，然后进行激光共聚焦显微成 像。 阳031] 优选的，所述溶液为生理盐水、缓冲范围内包括抑值为7. 4的缓冲液或水溶性有 机溶剂。 优选的，所述缓冲溶液的浓度为0. 01-0. 05mol/L。 优选的，所述含有巧光探针的溶液中的巧光探针的浓度为I-IOiimol/L。该浓度的 巧光探针可W对细胞或活体进行较好地成像。 本专利技术的有益效果为： (1)本专利技术的巧光探针的化学稳定性，光物理稳定性好；本专利技术的巧光探针在酸 性、中性和碱性等较宽的抑范围内对化都能响应敏感，与〇2'反应后的巧光强度至少可 W增强5倍，测定灵敏度较高，且响应时间极短。 (2)本专利技术的巧光探针对〇2 有很好的选择性，过氧化氨化2〇2)、叔下基过氧化氨 (TBHP)、次氯酸根（0C1 )、单线态氧（1〇2)、过氧化亚硝酷（ONOO)、径基自由基（?OH)、一氧 化氮（NO)，W及金属离子化化2\化2\Cu+与化2+对检测没有干扰；探针分子细胞渗透性 好，对细胞没有毒副作用，适于细胞内化浓度变化的检测。 (3)本专利技术的巧光探针对〇2的响应为可逆反应，可逆反应可W实现动态、实时的 观察〇2 的变化。 (4)本专利技术的巧光探针的合成步骤简单，容易纯化。【附图说明】 图1为本专利技术的探针I的双光子巧光强度和化变化的关系，其中，横坐标为波长 (nm)，纵坐标为巧光强度； W40]图2为本专利技术的探针I的巧光强度和不同浓度的〇2 的滴定曲线，其中，横坐标为 波长（nm)，纵坐标为巧光强度，右上的小图横坐标为〇2浓度，纵坐标为巧光强度； 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光探针，其特征在于：其结构式如下式Ⅰ所示：

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐波，李平，张雯，肖海滨，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37