同时利用蔗糖和甘油的新的产琥珀酸突变微生物和利用其生产琥珀酸的方法技术

本发明专利技术涉及同时利用蔗糖和甘油的新的产琥珀酸突变微生物和利用其生产琥珀酸的方法。具体而言，本发明专利技术涉及一种能同时利用蔗糖和甘油作为碳源的产琥珀酸突变微生物。尤其是，本发明专利技术涉及一种能同时利用蔗糖和甘油生产琥珀酸的产琥珀酸突变微生物，该突变生物是通过解除产琥珀酸微生物中蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制而获。当培养产琥珀酸突变微生物时，其同时地利用蔗糖和甘油，因此能以最大产量接近理论产量的高生产能力生产琥珀酸，同时最小化副产物的产生。此外，依据本发明专利技术，可以更低成本地产生以常规方法低产量生产的多种还原性化学品。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号为201180051937.6，申请日为2011年8月30日，专利技术名称为“同时利用蔗糖和甘油的新的产琥珀酸突变微生物和利用其生产琥珀酸的方法”的中国专利申请的分案申请。
本专利技术涉及一种能同时利用蔗糖和甘油作为碳源的产琥珀酸突变微生物。尤其是，本专利技术涉及一种能同时利用蔗糖和甘油以生产琥珀酸的产琥珀酸突变微生物，该突变微生物通过解除产琥珀酸微生物中的蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制而获得。
技术介绍
琥珀酸是一种包含四个碳原子的二羧酸并能够被用于多种工业应用。琥珀酸可作为工业重要化学品(包括己二酸、1,,4-丁二醇、乙二胺二琥珀酸盐、衣康酸、γ-丁内酯、γ-氨基丁酸和四氢呋喃)的前体使用，并且琥珀酸(包括其前体)的全球市场规模估计大约150亿美元(McKinlay等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,76:727,2007)。随着当下对环境可持续发展的兴趣和因石油储备量减少和由此导致的价格波动，过去十年进行了生物基琥珀酸生产方面的全球性研究(McKinlay等，Appl.Microbiol.Biotechnol.76:727，2007；Song等，EnzymeMicrobialTechnol.，39:352，2006；Jantama等，Biotechnol.Bioeng.，99:1140，2008)。尽管如此，时至今日已发现的任何种类的菌株都没有能够最大化琥珀酸的生产能力和产量的同时最小化副产>物的产生。当生产能力高时，效率低，反过来，当效率高时，生产能力低。进一步说，当生产能力高时，也产生了大量副产物。因此，一种能够增加生产能力和产量同时只生产琥珀酸的理想菌株尚未被发现(Jantama等，Biotechnol.Bioeng.，99:1140，2008)。蔗糖的价格是常用于微生物发酵生产琥珀酸的葡萄糖价格的大约1/4。同时，随着全球生物柴油制造的快速增长，产生了作为副产物的甘油，其价格因超量供应和需要一种处理甘油的适当的方法而下降。因此，甘油的价格非常低并持续的下降(Miller-KleinAssociates，Oct.2006)。大部分微生物从不同的碳源混合物中优先利用首选的碳源。为使其成为可能，大多数微生物拥有当首选碳源可用时抑制非首选碳源利用的分解代谢抑制机制(Gorke等，NatureReviews，6:613，2008)。在受分解代谢抑制机制调节的碳源的优先利用方面，众所周知，如1942年Monodetal.所报道的，大肠杆菌在葡萄糖和乳糖都存在时呈现二次生长。在这里，首选的碳源是葡萄糖，大肠杆菌的二次生长曲线中，显示了葡萄糖彻底消耗后的短的滞后期后，开始消耗非首选碳源乳糖。因为这个分解代谢抑制机制，对于常规曼海姆菌株很难同时利用蔗糖和甘油。不过，利用甘油作为碳源具有许多优势。甘油是高度还原性的，当它作为碳源使用时，在中间体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的生产中，比糖类(例如葡萄糖、木糖和蔗糖)产生多2倍的量的还原当量(NADH，NADPH，FADH2等)。因此，甘油对于还原性化学品的生长是引人注目的碳源。(Yazdani等，Curr.Opin.Biotechnol.，18:213，2007)。尽管如此，在很多情况下，在厌氧条件下的利用甘油的细胞生长速度比利用其他糖类的低，也因此使得利用甘油作为单一碳源虽然就还原力方面而言是有优势的，但是其显示出的低生长速度，使得在增加所需的生物产品的生产能力上受限制。为克服该限制，如果能通过同时利用比甘油有更高利用速度且能使细胞生长处于更高水平和速度的糖类(例如蔗糖)增加甘油的利用速度，细胞便可以以高速度生长的同时可利用甘油的高还原力的优势，由此可以有效地生产还原性化合物，特别是琥珀酸。因此，本专利技术人为开发通过同时利用廉价的蔗糖和甘油以高效率生产高纯度的琥珀酸的方法进行了广泛的努力，结果发现当培养通过从产琥珀酸微生物中删除果糖磷酸转移酶编码基因或向微生物引入甘油激酶编码基因而获得的产琥珀酸突变微生物时，可解除突变微生物中的分解代谢抑制机制从而使该突变微生物实现以常规方法不能达到的同时利用蔗糖和甘油生产琥珀酸、使副产物的产生最小化，和以高效率和非常高的生产能力生产均一琥珀酸(homo-succinicacid)，从而完成本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种突变微生物，其中解除了分解代谢抑制机制以便该微生物能够同时利用蔗糖和甘油，最大化琥珀酸的产量以接近理论水平，同时最小化副产物的产生，从而产生均一琥珀酸。本专利技术的另一个目的是提供一种在厌氧条件下利用蔗糖和甘油作为碳源在所述的突变微生物中生产均一琥珀酸且不产生副产物的方法。技术方案为达到上述目的，本专利技术提供了一种能够同时利用蔗糖和甘油以生产琥珀酸的突变微生物，该突变微生物通过解除产琥珀酸微生物中蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制而获得。本专利技术还提供了一种制备能利用蔗糖和甘油以获得产琥珀酸突变微生物的方法，该方法包括解除产琥珀酸微生物中蔗糖介导的甘油分解代谢抑制。本专利技术还提供一种生产琥珀酸的方法，该方法包括步骤：在厌氧条件下培养前述产琥珀酸突变微生物；和从发酵液中回收琥珀酸。附图说明图1示意性地显示了蔗糖和甘油的代谢途径和曼海姆菌株中的分解代谢抑制机制。确切地说，图1A显示了蔗糖和甘油常规的代谢途径和其中的分解代谢抑制机制，图1B显示了图1A中为解除分解代谢抑制机制有可能被代谢操作的部分(GLY，甘油；G3P，甘油-3-磷酸；SCR，蔗糖；G6P，葡萄糖-6-磷酸；FRU，果糖；F1P，果糖-1-磷酸；FBP，1,6-二磷酸果糖(果糖-1，6-二磷酸)；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；SUC，琥珀酸；PYR，丙酮酸；IIBCF，果糖磷酸转移酶系统IIBC单元(fructosePTSIIBCunit)；IIBCS，蔗糖磷酸转移酶系统IIBC单元(sucrosePTSIIBCunit)；EI，酶I；HPr，组氨酸蛋白；IIA，磷酸转移酶系统酶IIA(PTSenzymeIIA)；Fpr，双功能果糖特异性IIA/HPr蛋白；AC，腺苷酸环化酶；cAMP，环腺苷酸；CRP，环腺苷酸受体蛋白)。图2为一组显示了获自曼海姆产琥珀酸菌PALK(图2A)、曼海姆产琥珀酸菌PALFK(图2B)和曼海姆产琥珀酸菌PALKG(图2C)的分批补料培养物的细胞生长情况和代谢产物的图表。图3为显示了获自以增加的量接种的曼海姆产琥珀酸菌PALFK菌株的分批补料培养物的细胞生长情况和代谢产物的图表。图4A为显示了MCRB培养方法的示意本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产琥珀酸微生物的突变微生物，该突变微生物具有打破的编码果糖磷酸转移酶的基因(fruA)，其中产琥珀酸微生物选自以下组成的组：曼海姆菌属(Mannheimia sp.)菌、Basfia属菌(Basfia sp.)、放线杆菌属(Actinobacillus sp.)菌和厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum sp.)菌。

【技术特征摘要】
2010.08.30 KR 10-2010-00843271.一种产琥珀酸微生物的突变微生物，该突变微生物具有打破的编码果糖磷酸转移酶的基因
(fruA)，其中产琥珀酸微生物选自以下组成的组：曼海姆菌属(Mannheimiasp.)菌、Basfia属菌
(Basfiasp.)、放线杆菌属(Actinobacillussp.)菌和厌氧螺菌属(Anaerobiospirillumsp.)菌。
2.权利要求1所述的突变微生物，其中突变微生物具有引入的源自大肠杆菌的编码甘油激酶
的基因。
3.权利要求1或2所述的突变微生物，其中产琥珀酸微生物是曼海姆产琥珀酸菌PALK
(MannheimiasucciniciproducensPALK)(KCTC10973BP)。
4.权利要求3所述的突变微生物，其中突变微生物是曼海姆产琥珀酸菌PALFK(Mannheimia
succiniciproducensPALFK)(KCTC11694BP)。
5.权利要求3所述的突变微生物，其中突变微生物是曼海姆产琥珀酸菌PALKG(Mannheimia
succiniciproducensPALKG)(KCTC11693BP)。
6.权利要求1至5任一项所述的突变微生物，其中突变微生物同时利用甘油和蔗糖作为碳源
来生产琥珀酸。
7.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：李相烨，李政旭，崔松，李钟浩，
申请(专利权)人：韩国科学技术院，
类型：发明
国别省市：韩国;KR