一种β-半乳糖苷酶的固定化方法技术

本发明专利技术提供一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体固定β-半乳糖苷酶，包括固定化载体的制备和固定化β-半乳糖苷酶的制备，其中固定化载体的制备包括种子培养，细菌纤维素凝胶的制备，细菌纤维素凝胶的处理、打浆和细菌纤维素/海藻酸钠混合液的制备。本发明专利技术制备得到的细菌纤维素/海藻酸钙复合凝胶固定化β-半乳糖苷酶的酶活力回收率达到70～78％，最适pH偏碱性、增加至pH7.0～7.5，热稳定性提高、最适温度升高为40～45℃，米氏常数为9.5～10.5mmol/L，具有较好的稳定性和较高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶的固定化方法，尤其涉及一种β-半乳糖苷酶的固定化方法。
技术介绍
β-半乳糖苷酶，全名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，简称为乳糖酶，广泛存在于各种动物、植物及微生物中，β-半乳糖苷酶由β-半乳糖苷酶基因编码，由4个亚基组成的四聚体，一般可催化乳糖分解为葡萄糖和半乳糖。β-半乳糖苷酶的来源丰富，主要有细菌、霉菌、酵母等微生物，植物尤其是杏、扁桃和苹果，哺乳动物，特别是幼小哺乳动物的小肠中。其中微生物发酵制取β-半乳糖苷酶的生产成本低、产量高，周期短，所制取的酶源丰富，并且不受季节、地理位置的限制，在工业上得到广泛应用。游离的β-半乳糖苷酶的制备方法简单，但是生产成本较高，对耐酸碱稳定性较低，从而β-半乳糖苷酶的应用受到限制。酶的固定化是通过物理或者化学的方法，将酶固定在载体上，形成固定化酶，使其既保持酶的天然活性，又便于与反应液分离，可以反复使用。固定化酶具有较高的酶活性、稳定性高，可反复使用，耐一定强度的酸、碱、热及有机溶剂。固定化β-半乳糖苷酶也有明显的优势，人们对β-半乳糖苷酶的固定化技术的研究做了大量的工作。现有技术中，β-半乳糖苷酶的固定化方法主要有包埋法、吸附法、载体结合法和胶联法，常用的是单一方法或者两种或两种以上的方法结合使用，目前已报道的β-半乳糖苷酶固定化技术有纤维素包埋法，卡拉胶包埋法，聚丙烯酰胺包埋法；以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂，以明胶为载体、戊二醛为交联剂，r>以阳离子交换树脂为载体、戊二醛为交联剂相结合的方法；以凹凸棒吸附与壳聚糖包埋耦合的方法；海藻酸钠和卡拉胶相结合的方法。但是固定化载体的机械强度低，容易破碎或脱落，酶与载体的结合强度低。并且现有技术中没有涉及以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体制取固定化β-半乳糖苷酶的方法。
技术实现思路
：本专利技术提供一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体，通过交联剂交联β-半乳糖苷酶与细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶，增强复合凝胶的机械强度、亲水性和稳定性。为达到上述目的，本专利技术通过如下技术方案来实现：一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体，包括固定化载体的制备和固定化β-半乳糖苷酶的制备，其中固定化载体的制备包括种子培养，细菌纤维素凝胶的制备，细菌纤维素凝胶的处理、打浆和细菌纤维素/海藻酸钠混合液的制备。进一步，固定化载体的制备通过以下步骤实现：(1)种子培养：取活化的木醋杆菌CGMCCNo.1.1812斜面种子，接入在HS培养基中，在30℃下，160r/min，培养24h；(2)细菌纤维素凝胶的制备：以2-10％的接种量接入装有HS培养基的发酵容器中，30℃下培养2-6d，形成细菌纤维素凝胶。(3)细菌纤维素凝胶的处理、打浆：细菌纤维素凝胶用水冲洗，再将其浸泡于0.1mol/l的碱液中，100℃煮沸20min，再用蒸馏水或0.1mol/l的醋酸溶液冲洗，直至pH值为7.0，然后细菌纤维素凝胶湿重与磷酸盐缓冲液以质量/体积之比为1:1的比例置于打浆机中，转速为300-1000r/min，时间为5-15min，形成细菌纤维素乳浊液；(4)细菌纤维素/海藻酸钠混合液的制备：将海藻酸钠和细菌纤维素乳浊液以质量/体积之比为1:14的比例进行混合，水浴加热，边加热边搅拌，至海藻酸钠完全溶解，室温至冷却。进一步，固定化β-半乳糖苷酶的制备方法为：量取细菌纤维素/海藻酸钠混合液20-30ml，与20-30ml的β-半乳糖苷酶均匀混合，然后用注射器吸取混合液滴入氯化钙溶液中，充分反应2-6h，洗涤、离心、真空干燥得固定化β-半乳糖苷酶。进一步，固定化载体的制备方法步骤(2)中，培养方式为静置培养或振荡培养。进一步，固定化载体的制备方法步骤(2)中，培养方式为静置培养时，培养方法为：以2-10％的接种量接入装有HS培养基的浅层发酵容器中，装液面高度为1-2cm，30℃下静置培养2-6d，形成细菌纤维素凝胶；培养方式为振荡培养时，培养方法为：以2-10％的接种量接入装有HS培养基的发酵罐中，装液量为60-70％，30℃下振荡培养2-6d，转速为80-160rpm，形成细菌纤维素凝胶。进一步，固定化载体的制备方法步骤(2)培养方式为静置培养时，浅层发酵容器为托盘、锥形瓶或烧杯。进一步，固定化载体的制备方法步骤(3)中，碱液为NaOH、KOH、Na2CO3和K2CO3中任意一种，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.5mol/l、PH为5.0-8.0。进一步，固定化载体的制备方法步骤(3)中磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/l，PH为6.0。进一步，固定化β-半乳糖苷酶的制备方法中β-半乳糖苷酶的浓度为0.25-2.0mg/ml，氯化钙的浓度为55.3g/L。本专利技术还提供一种固定化β-半乳糖苷酶，是以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体，该固定化酶通过上述β-半乳糖苷酶的固定化方法制备得到。本专利技术的有益效果：(1)在固定化载体细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶的制备过程中，直接将打浆后的细菌纤维素添加至海藻酸钠中，提高了固定化载体的亲水性、稳定性和机械强度。(2)采用本专利技术载体及制备方法制备得到的固定化β-半乳糖苷酶活力回收率达到70-78％，最适pH偏碱性，为pH＝7.0-7.5，热稳定性提高，最适温度升高为40-45℃，米氏常数为10.5mmol/L。具体实施方式：下面结合具体实施例对本专利技术的内容进一步说明。实施例1本实施例的一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，包括固定化载体细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶的制备和固定化β-半乳糖苷酶的制备，步骤如下：(1)固定化载体的制备：a.种子培养：将购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的木醋杆菌CGMCCNo.1.1812斜面种子，接入装有100mlHS种子培养液中，在30℃下，160r/min，培养24h；b.细菌纤维素凝胶的制备：以10％(v/v)接种量接入装有HS发酵培养基的医用托盘，医用托盘的规格为38×50cm，其发酵液厚度为1cm，30℃下在恒温恒湿培养箱中静置培养6天；c.细菌纤维素凝胶的处理、打浆：将细菌纤维素凝胶用0.1mol/l的NaOH溶液煮沸处理6h后，用0.1mol/l的醋酸溶液清洗至细菌纤维素凝胶的pH为7.0，然后细菌纤维素凝胶湿重与浓度为0.01本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β‑半乳糖苷酶的固定化方法，其特征在于以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体，包括固定化载体的制备和固定化β‑半乳糖苷酶的制备，其中固定化载体的制备包括种子培养，细菌纤维素凝胶的制备，细菌纤维素凝胶的处理、打浆和细菌纤维素/海藻酸钠混合液的制备。

【技术特征摘要】
1.一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，其特征在于以细菌纤维素/海藻酸钠
复合凝胶为固定化载体，包括固定化载体的制备和固定化β-半乳糖苷酶的制备，
其中固定化载体的制备包括种子培养，细菌纤维素凝胶的制备，细菌纤维素凝胶
的处理、打浆和细菌纤维素/海藻酸钠混合液的制备。
2.根据权利要求1所述的一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，其特征在于固
定化载体的制备通过以下步骤实现：
(1)种子培养：取活化的木醋杆菌CGMCCNo.1.1812斜面种子，接入在
HS培养基中，在30℃下，160r/min，培养24h；
(2)细菌纤维素凝胶的制备：以2-10％的接种量接入装有HS培养基的发
酵容器中，30℃下培养2-6d，形成细菌纤维素凝胶；
(3)细菌纤维素凝胶的处理、打浆：细菌纤维素凝胶用水冲洗，再将其浸
泡于0.1mol/l的碱液中，100℃煮沸20min，再用蒸馏水或0.1mol/l的醋酸溶液冲
洗，直至pH值为7.0，然后细菌纤维素凝胶湿重与磷酸盐缓冲液以质量/体积之
比为1:1的比例置于打浆机中，转速为300-1000r/min，时间为5-15min，形成细
菌纤维素乳浊液；
(4)细菌纤维素/海藻酸钠混合液的制备：将海藻酸钠和细菌纤维素乳浊液
以质量/体积之比为1:14的比例进行混合，水浴加热，边加热边搅拌，至海藻酸
钠完全溶解，室温至冷却。
3.根据权利要求1所述的一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，其特征在于固
定化β-半乳糖苷酶的制备方法为：量取细菌纤维素/海藻酸钠混合液20-30ml，
与20-30ml的β-半乳糖苷酶均匀混合，然后用注射...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤卫华，王立晖，张乐，陈珊，龙尾，吕春晖，刘鑫龙，王玉姝，苑鹏，高媛，闫雪冰，
申请(专利权)人：天津现代职业技术学院，
类型：发明
国别省市：天津;12