一种基于生物砖串联双酶制备L-叔亮氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于生物砖串联双酶制备L-叔亮氨酸的方法，包括如下步骤：(1)构建能够串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的串联生物砖元件；(2)将上述串联生物砖元件导入大肠杆菌，构建基于串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的E.coli工程菌；(3)将上述E.coli工程菌接种于含氯霉素的液体扩大培养基中进行培养及诱导表达，获得发酵液，冷冻离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤、配制成细胞液；(4)将上述细胞液、三甲基丙酮酸、氨基供体、辅酶和用于辅酶再生的辅助底物置于缓冲体系中震荡反应，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物L-叔亮氨酸。本发明专利技术的方法产品转化率高，手性选择性较好，反应条件温和，操作简单，昂贵的辅酶可再生，单细胞表达双酶节约成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于L-叔亮氨酸制备
，具体涉及一种基于生物砖串联双酶制备L-叔亮氨酸的方法。
技术介绍
L-叔亮氨酸作为一种非天然手性氨基酸，因其疏水性叔丁基具有较大的空间位阻，在有机合成中比较容易控制分子构象，已经被广泛应用于化工、食品医药行业，特别是L-叔亮氨酸作为一种手性药物中间体，用于合成生物抑制剂，抗病毒、抗癌等。因此L-叔亮氨酸具有较高的商业应用价值，例如施贵宝公司利用L-叔亮氨酸作为药物中间体合成的抗艾滋病毒药物阿扎他韦(Atazanavir)2009年销售额为14亿美元。L-叔亮氨酸可通过化学合成法和生物合成法获得，但是化学合成法步骤多，对设备要求严格，收率低，并且易污染环境，工艺复杂，而生物转化法具有反应条件温和，对设备要求低，收率高，工艺简单，手性选择性高，环境污染小等优点，生物转化法已经被广泛应用于制备L-叔亮氨酸的产业中。生物催化法制备L-叔亮氨酸的方法可分为两个类：一是、利用酶拆分DL叔亮氨酸(如利用消旋酶，水解酶)和直接生物催化合成(如用亮氨酸脱氢酶)。但是前者理想产物L-叔亮氨酸的理论得率低于50％，后者虽然理论得率高但是需要利用额外添加大量昂贵的辅酶NADH。Krix等利用甲酸脱氢酶耦联亮氨酸脱氢酶，实现了昂贵辅酶的再生，然而这种方法辅酶投入量高达2mM，经济性较差。CN102978251.A公开的技术方案中中所用酶的投入量占底物的4％，且酶的用量太大，利用效率不高，不够经济。WeimingLiu等利用双质粒表达甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶，实现了辅酶的再生，然而这种方法需使用双倍的抗生素，不利于保护环境节约生产成本，且经济性较差。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种基于生物砖(biobrick)串联双酶制备L-叔亮氨酸的方法。本专利技术的具体技术方案如下：一种基于生物砖串联双酶制备L-叔亮氨酸的方法，包括如下步骤：(1)构建能够串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的串联生物砖元件，其中亮氨酸脱氢酶的基因序列如SEQID01所示，甲酸脱氢酶的基因序列如SEQID02所示；(2)将上述串联生物砖元件导入大肠杆菌，构建基于串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的E.coli工程菌；(3)将上述E.coli工程菌接种于含氯霉素的液体扩大培养基中进行培养及诱导表达，获得发酵液，冷冻离心获得细胞，用pH6.5～8.5的缓冲液重悬、洗涤、配制成终浓度为0.05～100g/L的细胞液；(4)将上述细胞液、三甲基丙酮酸、氨基供体、辅酶和用于辅酶再生的辅助底物置于pH＝6.0～13的缓冲体系中震荡反应，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物L-叔亮氨酸，三甲基丙酮酸、氨基供体、辅酶和辅助底物在上述缓冲体系中的终浓度分别为0.015～0.300mol/L、0.5～1.5mol/L、0.005～0.2mmol/L和0.5～1.5mol/L，上述辅酶为NAD+或NADH，上述反应的温度为20～45℃，反应的时间为20～120h，震荡速率为150～300rpm。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(1)为：1)构建能够单独表达所述亮氨酸脱氢酶的第一生物砖元件；2)构建能够单独表达所述甲酸脱氢酶的第二生物砖元件；3)用上述第一生物砖元件和第二生物砖元件构建能够串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的串联生物砖元件。进一步优选的，所述步骤1)为：a、以含亮氨酸脱氢酶基因的质粒pUC18-leudh为模板，用引物LeuDH-F1和LeuDH-R1进行PCR扩增，得到亮氨酸脱氢酶基因序列，其中LeuDH-F1和LeuDH-R1分别如SEQID3和SEQID4所示；b、用EcoRI和SpeI分别双酶切上述亮氨酸脱氢酶基因序列及终止子B0015，用T4DNA连接酶连接后形成质粒psB1C3-leudh-termintor转化大肠杆菌E.coliDH5α扩大培养，然后提取质粒psB1C3-leudh-termintor；c、用XbaI和PstI双酶切psB1C3-leudh-termintor，用SpeI和PstI双酶切psB1C3-LacI-rbs_B0034，用T4DNA连接酶连接后形成质粒B0034+LeuDH转化大肠杆菌E.coliDH5α扩大培养，然后提取质粒B0034+LeuDH，即得所述第一生物砖元件。进一步优选的，所述步骤2)为：a、以含亮氨酸脱氢酶基因的质粒pUC18-fdh为模板，用引物FDH-F1和FDH-R1进行PCR扩增，得到甲酸脱氢酶基因序列，其中FDH-F1和FDH-R1分别如SEQID5和SEQID6所示；b、用EcoRI和SpeI分别双酶切上述甲酸脱氢酶基因序列及终止子B0015，用T4DNA连接酶连接后形成质粒psB1C3-fdh-termintor转化大肠杆菌E.coliDH5α进行扩大培养，然后提取质粒psB1C3-fdh-termintor；c、用XbaI和PstI双酶切psB1C3-fdh-termintor，用SpeI和PstI双酶切psB1C3-LacI-rbs_B0034，用T4DNA连接酶连接后形成质粒B0034+FDH转化大肠杆菌E.coliDH5α扩大培养，然后提取质粒B0034+FDH，，即得所述第二生物砖元件。进一步优选的，所述步骤3)为：用XbaI和PstI双酶切所述第一生物砖元件，用SpeI和PstI双酶切所述第二生物砖元件，用T4DNA连接酶连接后形成质粒B0034+LeuDH-B0034+FDH转化大肠杆菌E.coliDH5α扩大培养，然后提取质粒B0034+LeuDH-B0034+FDH，即得所述串联生物砖元件。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述含氯霉素的液体扩大培养基的配方为：胰蛋白胨6.0～15.0g/L，酵母浸膏1.0～10.0g/L，NaCl5.0～15.0g/L，pH7.0～8.0，去离子水为溶剂，接种前添加氯霉素至终浓度为50～150ug/mL；进一步优选的，所述步骤(3)的培养条件如下：37℃，150～220rpm培养2～3h后加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10～30mg/ml，继续在25～30℃，150～250rpm下培养4～8h。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述氨基供体为氨水、甲酸铵、NH4Cl和NH4NO3中的至少一种。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述辅助底物为甘油、葡萄糖、木糖、异丙醇和半乳糖中的至少一种。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(3)中的缓冲液为PBS。在本专利技术的一个优选实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于生物砖串联双酶制备L‑叔亮氨酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)构建能够串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的串联生物砖元件，其中亮氨酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID 01所示，甲酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID 02所示；(2)将上述串联生物砖元件导入大肠杆菌，构建基于串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的E.coli工程菌；(3)将上述E.coli工程菌接种于含氯霉素的液体扩大培养基中进行培养及诱导表达，获得发酵液，冷冻离心获得细胞，用pH6.5～8.5的缓冲液重悬、洗涤、配制成终浓度为0.05～100g/L的细胞液；(4)将上述细胞液、三甲基丙酮酸、氨基供体、辅酶和用于辅酶再生的辅助底物置于pH＝6.0～13的缓冲体系中震荡反应，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物L‑叔亮氨酸，三甲基丙酮酸、氨基供体、辅酶和辅助底物在上述缓冲体系中的终浓度分别为0.015～0.300mol/L、0.5～1.5mol/L、0.005～0.2m mol/L和0.5～1.5mol/L，上述辅酶为NAD+或NADH，上述反应的温度为20～45℃，反应的时间为20～120h，震荡速率为150～300rpm。...

【技术特征摘要】
1.一种基于生物砖串联双酶制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)构建能够串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的串联生物砖元件，其中亮氨酸
脱氢酶的基因序列如SEQID01所示，甲酸脱氢酶的基因序列如SEQID02所示；
(2)将上述串联生物砖元件导入大肠杆菌，构建基于串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸
脱氢酶的E.coli工程菌；
(3)将上述E.coli工程菌接种于含氯霉素的液体扩大培养基中进行培养及诱导表达，
获得发酵液，冷冻离心获得细胞，用pH6.5～8.5的缓冲液重悬、洗涤、配制成终浓度为
0.05～100g/L的细胞液；
(4)将上述细胞液、三甲基丙酮酸、氨基供体、辅酶和用于辅酶再生的辅助底物置
于pH＝6.0～13的缓冲体系中震荡反应，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物L-叔亮
氨酸，三甲基丙酮酸、氨基供体、辅酶和辅助底物在上述缓冲体系中的终浓度分别为
0.015～0.300mol/L、0.5～1.5mol/L、0.005～0.2mmol/L和0.5～1.5mol/L，上述辅酶为NAD+或NADH，上述反应的温度为20～45℃，反应的时间为20～120h，震荡速率为150～300rpm。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)为：
1)构建能够单独表达所述亮氨酸脱氢酶的第一生物砖元件；
2)构建能够单独表达所述甲酸脱氢酶的第二生物砖元件；
3)用上述第一生物砖元件和第二生物砖元件构建能够串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸
脱氢酶的串联生物砖元件。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)为：
a、以含亮氨酸脱氢酶基因的质粒pUC18-leudh为模板，用引物LeuDH-F1和LeuDH-R1
进行PCR扩增，得到亮氨酸脱氢酶基因序列，其中LeuDH-F1和LeuDH-R1分别如SEQID
3和SEQID4所示；
b、用EcoRI和SpeI分别双酶切上述亮氨酸脱氢酶基因序列及终止子B0015，用T4
DNA连接酶连接后形成质粒psB1C3-leudh-termintor转化大肠杆菌E.coliDH5α扩大培养，
然后提取质粒psB1C3-leudh-termintor；
c、用XbaI和PstI双酶切psB1C3-leudh-termintor，用SpeI和PstI双酶切
psB1C3-LacI-rbs_B0034，用T4DNA连接酶连接后形成质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：方柏山，江伟，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35