一种汞螯合型免疫复合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种汞螯合型免疫复合物及其制备方法和应用，该汞螯合型免疫复合物为以下复合物中的一种：汞离子结合于免疫复合物形成的复合物，或汞离子结合于载体蛋白及能和该载体蛋白特异性结合的抗体所形成的复合物；或汞离子结合于免疫球蛋白后与载体蛋白结合形成的复合物。本发明专利技术所述汞螯合型免疫复合物的是一种相对特异性的免疫复合物，用于检测地区人群血清中是否汞螯合型免疫复合物及含量，间接反映这个地区汞污染程度。

【技术实现步骤摘要】
一种汞螯合型免疫复合物及其制备方法和应用
本专利技术涉及属于医学领域，具体涉及汞螯合型免疫复合物及其制备方法和应用。
技术介绍
免疫复合物(Immunecomplexes，IC)是抗原抗体结合的产物，根据全国科学技术名词审定委员会的定义，是指抗体与可溶性抗原结合而形成的复合物。它分为两类，一种是组织中固定的免疫复合物，而另一种则是游离于血液中的免疫复合物，成为循环免疫复合物(circulatingimmunecomplexes，CIC)。免疫复合物在清除和破坏各种抗原中起着不可缺少的作用，机体免疫反应的结果就是不断产生免疫复合物。当机体内抗原(或抗体)数量略多于抗体(或抗原)时，就会形成中等分子大小的免疫复合物，它既不易被吞噬细胞吞噬，又不能通过肾小球滤孔排出，可较长时间游离于血液和其他体液中。当血管壁通透性增加时，此类IC可随血液沉积在某些部位的毛细血管壁或嵌合在肾小球基底膜上，激活补体导致免疫复合物沉积。这些沉积或镶嵌于血管壁或组织的免疫复合物，乃造成血管基膜炎症和组织损伤的始动因素。免疫复合物可通过以下几方面造成组织损伤：1)激活补体：沉积的IC通过激活补体，产生过敏毒素和具有趋化效应的活性片段，趋化至局部的肥大细胞、嗜碱性粒细胞释放活性介质致局部血管通透性增高，引起渗出和局部水肿；2)吸引白细胞浸润和集聚：中性粒细胞在吞噬IC时释放毒性氧化物和溶酶体酶，损伤邻近组织；3)活化血小板：IC可通过活化血小板释放血管活性胺类物质，导致血管扩张、通透性增加，加剧局部渗出和水肿，并激活凝血机制，形成微血栓，引起局部缺血、出血和组织坏死。多种疾病的发生都与免疫复合物的沉积息息相关，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、肾病综合征、冷球蛋白血症、脉管炎、细菌、病毒和寄生虫感染、过敏反应、自身免疫疾病、皮肤病等。早在上世纪90年代，就有学者发现，在正常机体中，免疫复合物被不断降解，因而一般检测不到免疫复合物或只呈现低浓度，而在上述一系列疾病中，血清中的免疫复合物即CIC含量显著升高。虽然CIC检测不具有疾病特异性，但其检测能提供关于免疫病理、疾病的发展及预后方面的信息。在某些微生物感染、自身免疫中，检测循环免疫复合物可用作疾病活动性、评价机体的机能和检测疗效的指标。而近些年来，学者们致力于研究特异性的免疫复合物，研究各种特异性免疫复合物与疾病致病、疾病发展、疾病诊断等各方面的关系，而这些研究将促使我们对疾病有更深一步了解。汞(Mercury，Hg)是一种无处不在的重金属，广泛应用于工业、农业、医药业，是一种非常重要的环境污染物。2011年，美国毒物和疾病登记署(UnitedStatesAgencyforToxicSubstancesandDiseaseRegistry，ATSDR)已将其列入物质优先列表内(SubstancePriorityList)，而世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)也早已将其列为10大最易引起健康问题的化学品之一。在美国，Hg被认为是四大环境污染物之一，严重影响着人们的身体健康。常见的汞职业暴露人群包括从事金属冶炼、开采金矿、烧煤、电产业和木材生产的人群，而对于普通人群主要通过食入汞污染的海鲜、饮入汞污染水源、吸入燃料燃烧或蒸发的汞蒸汽。此外，含汞化妆品的接触、填充汞合金牙科填充物、接触疫苗防腐剂中的乙基汞、含汞杀虫剂的接触都是常见的汞暴露方式，汞与人们的生活密切相关。2009年，国家健康与营养测试调查中发现(NationalHealthandNutritionExaminationStudy,NHANES)，2％的美国育龄期妇女体内的汞都超标，可见汞污染是一个亟待解决的问题。2004年美国学者A.Ramanaviciene等发现血清中循环免疫复合物含量与地方环境污染有关，发现随着地区污染严重程度的增加，当地牛血清中的CIC含量显著增加，差异具有统计学意义，因而可以作为评价地区污染的指标。但环境污染究竟是如何刺激机体内CIC含量显著升高，是一种还是多种污染物共同作用导致其升高，CIC的升高是否因此会导致机体损伤，增加机体对于疾病的易感性，这些都有待研究。众所周知，循环免疫复合物是一种特殊意义的蛋白质，而汞可作用于全身多个系统的蛋白质，汞是否可以作用于循环免疫复合物，而使循环免疫复合物含量改变、活性改变、功能改变，这些尚缺乏相关研究。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种汞螯合型免疫复合物，该汞螯合型免疫复合物是一种相对特异性的免疫复合物，用于检测地区人群血清中是否存在汞螯合型免疫复合物及其含量，间接反映这个地区汞污染程度。为解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种汞螯合型免疫复合物，该汞螯合型免疫复合物为以下复合物中的一种：汞离子结合于免疫复合物形成的复合物，或汞离子结合于载体蛋白及能和该载体蛋白特异性结合的抗体所形成的复合物；或汞离子结合于免疫球蛋白后与载体蛋白结合形成的复合物。进一步地，所述载体蛋白或免疫复合物至少含有锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中一种结构，汞离子通过锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中至少一种与载体蛋白或免疫复合物结合。具体的，所述载体蛋白为抗体蛋白、脂蛋白、血红蛋白、核抗原、异种血清抗原、病毒、细菌、原虫、蠕虫中的一种。进一步的，汞离子通过螯合剂与载体蛋白结合后再与能和载体蛋白特异性结合的抗体结合。进一步的，所述螯合剂为ITCBE、EDTA、多磷酸盐、氨基羧酸、1,3-二酮、羟基羧酸中的一种。本专利技术还提供了两种制备汞螯合型免疫复合物的方法，通过这两种方法获得汞螯合型免疫复合物。其中，第一种制备方法包括A)合成汞螯合型免疫复合物的步骤：先将螯合剂与载体蛋白结合，再与汞离子络合；B)提纯汞螯合型免疫复合物的步骤：采用免疫亲和层析法去除步骤A)合成的汞螯合型免疫复合物中未参与反应的载体蛋白、特异性抗体及汞离子。具体地，所述汞螯合型免疫复合物的制备方法中，(Ⅰ)配制螯合剂溶液：将螯合剂溶解，配制成螯合剂溶液；(Ⅱ)配制载体蛋白溶液：将载体蛋白加入到硼酸盐缓冲溶液中，制得载体蛋白溶液；(Ⅲ)搅拌过夜：将步骤(I)螯合剂溶液加入到步骤(II)的载体蛋白溶液中，搅拌后于摇床作用2-30h，得到混合液；(Ⅳ)透析袋预处理：在透析袋中加入EDTA-NaHCO3溶液煮沸，弃废液后用ddH2O冲洗，重复该步骤1-3次；(V)透析：将步骤(III)的混合液装入经步骤(Ⅳ)处理后的透析袋中，用ddH2O透析，换水2-3次，4℃透析过夜之后，收集液体；(VI)汞离子螯合：在上述步骤(V)中的液体中加入HCl溶液调整pH至7.0，缓慢加入汞离子溶液，边滴加边震荡，之后于摇床作用2-30h，然后重复步骤(V)一次，收集液体，得到汞螯合型抗原；(VII)结合：在上述汞螯合型抗原中加入能与载体蛋白特异性结合的抗体，反应后得到汞螯合型免疫复合物；所述步骤B)具体步骤如下：(i)将上述A)步骤合成的汞螯合型免疫复合物复溶于生理盐水中；(ii)层析柱预处理：使用稀释缓冲液冲洗管路，在层析柱中装入能与免疫复合物特异性结合的填料，装柱后继续用稀释缓冲液平衡柱子；所述能与免疫复合物特异性结合的填料为吸附有可与免疫复合物特异性结合物质的硅胶或树脂；(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种汞螯合型免疫复合物，其特征在于，该汞螯合型免疫复合物为以下复合物中的一种：汞离子结合于免疫复合物形成的复合物，或汞离子结合于载体蛋白及能和该载体蛋白特异性结合的抗体所形成的复合物；或汞离子结合于免疫球蛋白后与载体蛋白结合形成的复合物。

【技术特征摘要】
1.一种汞螯合型免疫复合物，其特征在于，该汞螯合型免疫复合物为汞离子结合于载体蛋白及能和该载体蛋白特异性结合的抗体所形成的复合物；所述的汞螯合型免疫复合物通过以下制备方法获得：A）合成汞螯合型免疫复合物的步骤；（Ⅰ）配制螯合剂溶液：将螯合剂溶解，配制成螯合剂溶液；（Ⅱ）配制载体蛋白溶液：将载体蛋白加入到硼酸盐缓冲溶液中，制得载体蛋白溶液；（Ⅲ）搅拌过夜：将步骤（I）螯合剂溶液加入到步骤（II）的载体蛋白溶液中，搅拌后于摇床作用2-30h，得到混合液；（Ⅳ）透析袋预处理：在透析袋中加入EDTA-NaHCO3溶液煮沸，弃废液后用ddH2O冲洗，重复该步骤1-3次；（V）透析：将步骤（III）的混合液装入经步骤（Ⅳ）处理后的透析袋中，用ddH2O透析，换水2-3次，4℃透析过夜之后，收集液体；（VI）汞离子螯合：在上述步骤（V）中的液体中加入HCl溶液调整pH至7.0，缓慢加入汞离子溶液，边滴加边震荡，之后于摇床作用2-30h，然后将得到的液体装入经步骤（Ⅳ）处理后的透析袋中，用ddH2O透析，换水2-3次，4℃透析过夜之后，收集液体，得到汞螯合型抗原；（VII）结合：在上述汞螯合型抗原中加入能与载体蛋白特异性结合的抗体，反应后得到汞螯合型免疫复合物；B）提纯汞螯合型免疫复合物的步骤：采用免疫亲和层析法去除步骤A）合成的汞螯合型免疫复合物中未参与反应的载体蛋白、和该载体蛋白特异性结合的抗体及汞离子；（i）将上述A）步骤合成的汞螯合型免疫复合物复溶于生理盐水中；（ii）层析柱预处理：使用稀释缓冲液冲洗管路，在层析柱中装入能与免疫复合物特异性结合的填料，装柱后继续用稀释缓冲液平衡柱子；（ii）上样：待柱子平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（i）所得溶液，然后上柱，汞螯合型免疫复合物吸附在填料上，未反应的载体蛋白、抗体、汞离子随稀释缓冲液流出；（iv）洗脱：使用稀释缓冲液冲洗柱子，至基线平衡，然后使用0.05-0.10Mol/L的Na2HPO4溶液进行洗脱；（v）收集：收集步骤（iv）的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；（vi）收集到的洗脱液装入透析袋用ddH2O透析除盐，换水2-4次后，4℃透析过夜，收集样本；（vii）层析柱预处理：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与汞特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡柱子；（viii）上样：待步骤（vii）的柱子平衡后，用稀释缓冲液稀释上述步骤（vi）的样本，然后将稀释后的样本上柱，汞螯合型免疫复合物吸附在填料上，未反应的抗原抗体复合物会随稀释缓冲液流出；（ix）洗脱：步骤（viii）之后用稀释缓冲液冲洗柱子，至基线平衡，然后使用0.5-1.0Mol/L的Na2HPO4溶液进行洗脱；（x）收集：收集步骤（ix）的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；（xi）将步骤（x）的洗脱液装入透析袋用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得到纯化的汞螯合型免疫复合物。2.根据权利要求1所述的汞螯合型免疫复合物，其特征在于，所述载体蛋白至少含有锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中一种结构，汞离子通过锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中至少一种与载体蛋白结合。3.根据权利要求2所述的汞螯合型免疫复合物，其特征在于，所述载体蛋白为抗体蛋白、脂蛋白、血红蛋白、核抗原、异种血清抗原、病毒、细菌、原虫、蠕虫中的一种。4.根据权利要求1所述的汞螯合型免疫复合物，其特征在于，其中，汞离子通过螯合剂与载体蛋白结合后再与能和载体蛋白特异性结合的抗体结合。5.一种如权利要求1所述的汞螯合型免疫复合物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：A）合成汞...

【专利技术属性】
技术研发人员：张积仁，阳帆，董欣敏，吴婧，蔡睿，孙遥，赵乙木，
申请(专利权)人：上海拜豪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31