一种猴子早期胚胎转基因敲入的PCR鉴定方法技术

本发明专利技术属于分子生物学及基因工程领域，涉及一种猴子早期胚胎转基因敲入的PCR鉴定方法。含有0.2-0.5µl培养基的单个注射完的早期胚胎收集于薄壁透明PCR管底部；用枪头小心加入DLB裂解液5µl至PCR管底部，不要接触到含有胚胎的培养基；置于冰上裂解15-30min释放基因组DNA；裂解产物直接全部用于全基因组扩增反应；然后用两轮巢式PCR扩增方法进行转基因敲入鉴定。本发明专利技术的方法能稳定地对少至只有16个细胞的猴子单个胚胎进行操作，所有操作步骤一直在同一PCR管中操作，防止操作过程造成微量基因组的丢失。同时，高保真横向扩增的方法拓展了基因组的下游应用，按照此方法可稳定、准确、简便地实现对猴子单个胚胎基因组敲入的快速PCR鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学及基因工程领域，涉及一种猴子早期胚胎转基因敲入的PCR鉴定方法。
技术介绍
随着全基因组测序技术的不断发展完善以及大型基因组注释项目的实施，生物科学的研究进入后基因组时代。在后基因组时代，基因组研究的重心将转向基因功能，即由测定基因的DNA序列、解释生命的所有遗传信息转移到从分子整体水平对生物学功能的研究上，在分子层面上探索人类健康和疾病的奥秘。科研人员们已经开始通过各种尝试，想要将基因组研究的成果尽早地运用到基础科学研究的各个领域，以及个性化医疗工作当中。不过面对海量枯燥的基因组信息，科研人员们该如何将这些数据转换成有意义的基因组功能？解决这个问题的一个很好方法是通过转基因技术对基因进行操作改造以实现研究基因功能的目的。近十年来出现了一种新的研究手段，可以帮助科研人员对各种细胞和各种生物体内的几乎任意基因进行人工操作。这种新技术就是我们常说的“基因组编辑技术”，比如锌指核酸酶、转录激活因子样效应因子核酸酶、基于成簇的规律间隔的短回文重复序列和Cas蛋白的DNA核酸内切酶等介导的基因编辑技术。如图1所示常见的基因组编辑方式，这些核酸酶能够对基因组进行人工修饰，其基本原理是在靶位点区诱发DNA双链缺口(double-strain breaks, DSBs)，然后启动非同源区的末端连接(NHEJ) DSB修复机制产生突变或是利用同源重组(HR)修复机制在同源模版存在的情况下完成我们所需要的各种人工修饰。在转基因操作实践中，一般制造转基因动物的流程是往受精卵中注入各种基因组编辑所需组分，然后体外培养数天至早期胚胎阶段后移植进受体子宫中孕育产下后代。最后，取产下后代的局部组织进行基因组DNA提取并进行转基因成功与否的鉴定。但是，在实际应用中还存在有些情况需要在早期胚胎阶段对转基因成功与否进行鉴定。比如，预实验需要体内验证所选的基因组编辑体系是否工作，为了缩短实验时间，可以在注射完几天的早期胚胎阶段进行转基因鉴定。特别是对于一些如猴子等非人灵长类动物来说，由于整个生殖周期较长，这种在早期胚胎进行鉴定的方法有很大的优势。但是，对于早期胚胎来说，这个时期基因组的DNA的提取及操作存在比较大的挑战。这个时期只有少量的细胞，基因组含量属于微量级别。在大鼠小鼠等动物上，常见的方法一般是直接裂解完进行PCR，或者裂解完用酚氯仿进行抽提，但是这些方法存在很大的局限性。第一，这种方法经常不具备很好的可重复性，而且提取过程中很难控制微量的基因组不丢失。第二，即使成功提取微量基因组通常也只够用于一次的检测实验，无法提供更多的基因组应用于其他实验需要。Sakurai等(Sakurai T, Watanabe S，Kamiyoshi A,Sato M, Shindo T.A single blastocyst assay optimized for detecting CRISPR/Cas9system-1nduced indel mutat1ns in mice.BMC B1technology, 2014, 14(1): 69.)报道采用全基因组扩增的方法提取小鼠的早期胚胎进行转基因鉴定。用10 μ?含有蛋白酶K、Tr1-HCL, KCL、明胶、TWeen20、酵母tRNA等多个组分的裂解液进行裂解。然后取4 μ?裂解产物采用Qiagen公司的REPL1-g Mini Kit全基因组扩增试剂盒加入全量的酶进行扩增。首先，此方法操作的小鼠早期胚胎通常处于具有上百个细胞的时期，而对于细胞含量很少的猴子早期胚胎不一定适用。其次，裂解液成分中加入的蛋白酶K、明胶、酵母tRNA等成分额外增加实验的成本。第三，全基因组扩增时所用的试剂盒使提取基因组的成本大大提高，同时对微量基因组进行扩增检测很容易发生漏检。因此，本研究专利技术了一种基因组编辑技术介导的转基因敲入猴子早期胚胎PCR鉴定的方法，能稳定地对少至只有16个细胞的猴子单个早期胚胎进行操作，所有操作步骤在同一 PCR管中进行，防止操作过程造成微量基因组的丢失。同时，高保真横向扩增的方法拓展了基因组的下游应用，稳定地实现猴子单个胚胎基因敲入的快速鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种稳定、准确、灵敏、简便的基因组编辑技术介导的转基因敲入猴子单个早期胚胎PCR鉴定方法。而且费用较适中，使用的所有检测试剂方便获得。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案: 一种猴子早期胚胎转基因敲入的PCR鉴定方法，含有0.2-0.5μ1培养基的单个注射完的早期胚胎收集于薄壁透明PCR管底部；用枪头小心加入DLB裂解液5 μ?至PCR管底部，不要接触到含有胚胎的培养基；置于冰上裂解15-30min释放基因组DNA;裂解产物直接全部用于全基因组扩增反应。第一轮PCR反应体系:50 μ?的反应体系中加入5 μ? 1xExTaq Buffer,4 μ?的2.5 mM dNTPs，10 μΜ OFl 和 0R2 引物各 1.5 μ1，0.25 μ? TaKaRa ExTaq，I μ? 全基因组扩增产物，其余为无菌水；98°C预变性1s后进入循环:98°C变性10s，60°C退火30s，72°C延伸3min，40个循环，最后72°C延伸10 min ;取5 μ?扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测；以第一轮PCR产物为模版，分别用引物IFl、IRl以及IF2、IR2进行巢式第二轮PCR扩增，鉴定转基因敲入，PCR反应体系如同第一轮，退火温度为55°C，延伸时间为lmin，对PCR产物进行克隆测序鉴定。设计左同源臂以外正向引物OFl及右同源臂以外反向引物0R2，以单个胚胎全基因组扩增产物进行第一轮PCR，鉴定基因组质量，同时对潜在的成功转基因敲入片段进行扩增，其次设计左同源臂以外，OFl以内的巢式正向引物IFl及插入片段上的反向引物IR1，以第一轮PCR产物为模版进行左臂插入的鉴定，设计右同源臂以外，0R2以内的巢式反向引物IR2及插入片段上的正向引物IF2，以第一轮PCR产物为模版进行右臂插入的鉴定。所述OFl和0R2 ;IF1和IRl ;IF2和IR2引物根据所选择转基因敲入位点及敲入外源片段序列设计。本专利技术的优点在于:成功实现了一种成功率超过80%的基因组编辑技术介导的转基因敲入猴子单个早期胚胎PCR鉴定方法。本专利技术的方法能稳定地对少至只有16个细胞的猴子单个胚胎进行操作，所有操作步骤一直在同一 PCR管中操作，防止操作过程造成微量基因组的丢失。同时，高保真横向扩增的方法拓展了基因组的下游应用，按照此方法可稳定、准确、简便地实现对猴子单个胚胎基因组敲入的快速PCR鉴定。单个胚胎的费用在50 元人民币左右，费用较适中。【附图说明】图1常见的基因组编辑方式:目标DNA在基因组编辑酶的作用下在特定位置产生双链断裂(DSBs)。然后通过非同源末端连接修复(NHEJ)途径进行修复，导致插入突变或者删除突变等的发生。如果有同源修复模版的存在，能够通过同源重组(HR)进行修复，产生精确的外源序列插入。图2食蟹猴单个早期胚胎转基因注射发育至16个细胞时期。图3 HR修复途径介导的外源片段插入转基因结果PCR鉴定:在同源臂以外的基因组区域设计一对引物OFl和0R2进行第一轮PCR扩增。然本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猴子早期胚胎转基因敲入的PCR鉴定方法，其特征在于：含有0.2‑0.5µl培养基的单个注射完的早期胚胎收集于薄壁透明PCR管底部；用枪头小心加入DLB裂解液5 µl至PCR管底部，不要接触到含有胚胎的培养基； 置于冰上裂解15‑30min释放基因组DNA; 裂解产物直接全部用于全基因组扩增反应。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈文锋，杨宇丰，孙玲，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建;35