间充质干细胞的三维诱导培养方法技术

本发明专利技术涉及一种间充质干细胞的三维诱导培养方法，包括以下步骤：获取间充质干细胞；将间充质干细胞与可溶性的海藻酸盐混合后，加入除镁离子以外的二价金属离子盐溶液中，至形成凝胶球；用诱导剂对凝胶球内的间充质干细胞进行诱导培养。通过利用海藻酸胶体的三维空间结构，为间充质干细胞提供一个模拟体内生长的微环境，扩大了间充质干细胞的生长空间，以及与培养液及细胞间的物质信号交流，促进间充质干细胞的生长分化，提高转化率，增强细胞活性；同时，相较于现有技术中的共培养方式，本发明专利技术也可省去分离两种细胞的过程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞工程
，特别涉及一种间充质干细胞的三维诱导培养方 法。
技术介绍
关节软骨组织缺损在当代是一种常见的疾病，由肿瘤引起的损伤、由年龄引起的 病变，各种各样的遗传疾病和软骨组织异常生长以及外伤都能造成关节软骨的损伤和缺 失。关节软骨自我修复能力较低，主要有两个方面的原因：一是软骨细胞属于终末分化细 胞，代谢活性低，自我增殖能力差；二是软骨组织没有血管和神经。临床上最常应用的是一 种所谓的微骨折的手术治疗方法，该方法是将一根细针穿透受损软骨组织直达骨髓，诱使 骨髓细胞（含间充质干细胞）随着血液流到破损之处，而后经过原位诱导间充质干细胞形 成软骨细胞。但此修复方法最终形成的是一种纤维软骨，与正常的透明软骨组织比较，纤维 软骨含有的II型胶原与软骨聚集蛋白聚糖的含量较低，不能完全替代正常的软骨功能，长 期的治疗效果不理想。当传统方法不能有效解决关节软骨缺损疾病时，并且随着生物技术的发展，软骨 组织工程有希望能够解决软骨组织再生的难题。在软骨组织工程中，软骨细胞有两大缺陷， 首先是细胞来源受到限制，其次是软骨细胞在体外培养时会发生去分化的显像，丧失软骨 细胞表型以及分泌特定的胞外基质的能力。三维支架材料可以有效地维持软骨细胞形态， 但软骨细胞在支架材料上的增殖速率相对于平面培养仍然较低，难以获得足够量的细胞。 而间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，它能够定向诱导为胰岛样细 胞、软骨细胞等多种细胞。且间充质细胞存在于人体多种组织中，尤其是脐带、胎盘、骨髓、 脂肪组织来源的间充质干细胞，具有来源广泛、易于采集、无伦理问题等优势，可规模化诱 导分化为软骨细胞，为临床治疗关节软骨损伤提供新的技术方案。但目前多采用间充质干 细胞与软骨细胞共培养的方式诱导间充质干细胞转化为软骨细胞，这种共培养方式不仅诱 导转化率低，而且细胞活性较低，软骨细胞分离较困难，免疫性低等。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对现有技术中共培养间充质干细胞和软骨细胞 获得软骨细胞的方式存在诱导率低，细胞活性差，两种细胞分离困难等缺陷，提供一种能够 提高间充质干细胞的诱导转化率，增强细胞活性且易分离的间充质干细胞的三维诱导培养 方法。 本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种间充质干细胞的三维诱导 培养方法，包括以下步骤： 获取间充质干细胞； 将间充质干细胞与可溶性的海藻酸盐混合后，再与除镁离子以外的二价金属离子 盐溶液混合，至形成凝胶球； 用诱导剂对凝胶球内的间充质干细胞进行诱导培养。 在本专利技术提供的中，所述凝胶球的形成过程 为：将所述间充质干细胞与可溶性的海藻酸盐混合后匀速滴入除镁离子以外的二价金属离 子盐溶液中。 在本专利技术提供的中，所述海藻酸盐为海藻酸 钠，且与所述间充质干细胞混合之前，海藻酸钠的浓度为2% -10% W/V。 在本专利技术提供的中，所述二价金属离子盐溶液 为氯化钙溶液，且氯化钙的浓度为1% -5 % W/V。 在本专利技术提供的中，对所述凝胶球内的间充质 干细胞进行诱导培养之前，还包括清洗凝胶球的步骤。 在本专利技术提供的中，采用基础培养基清洗凝胶 球。 在本专利技术提供的中，所述诱导剂包括5-15ng/ ml的TGF-0、7_10mmol/l地塞米松、50-100ug/ml抗坏血酸、5_15mmol/l甘油磷酸钠和 50_150ng/ml 的 ITS+Premix〇 在本专利技术提供的中，所述诱导剂还包括胰岛素 和转铁蛋白，所述胰岛素的浓度为5-10mg/ml，转铁蛋白的浓度为5-10mg/ml。 在本专利技术提供的中，所述诱导剂还包括谷氨酰 胺，所述谷氨酰胺的浓度为l-10mm〇L/L。 在本专利技术提供的中，对所述凝胶球中的间充质 干细胞的诱导培养过程是在生物反应器中进行的。 实施本专利技术提供的，可以达到以下有益效果： 通过利用海藻酸胶体的多孔三维空间结构，为间充质干细胞提供一个模拟体内骨髓三维微 环境，扩大了间充质干细胞的生长空间，以及与培养液及细胞间的物质信号交流，促进间充 质干细胞的生长分化，提高转化率，增强细胞活性；同时，相较于现有技术中的共培养方式， 本专利技术也可省去分离两种细胞的过程。【附图说明】 下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中： 图1为本专利技术提供的检测实验三中，根据Chs标准样品工作液的浓度及其0D值所 制作的标准曲线图。【具体实施方式】 为解决现有技术中利用间充质干细胞与软骨细胞共培养获得软骨细胞的方式存 在诱导周期长，转化率低，细胞分离困难，免疫安全性低，需要软骨细胞源等缺陷，本专利技术的 创新点在于提供一种单独诱导间充质干细胞转化成软骨细胞的方法，通过利用海藻酸凝胶 的三维结构，模拟细胞在体内的生存环境，为间充质干细胞提供充足的生长空间，增加间充 质干细胞与培养液的接触面积，从而实现了提高间充质干细胞的转化率，增强细胞活性并 可免去分离细胞步骤的目的。 本专利技术提供的，包括以下步骤： -、获取间充质干细胞； 二、将间充质干细胞与可溶性的海藻酸盐混合后，加入除镁离子以外的二价金属 离子盐溶液中，至形成凝胶球； 三、清洗凝胶球后，用诱导剂对凝胶球内的间充质干细胞进行诱导培养7-28天。 步骤一中，间充质干细胞可来源于脐带、胎盘、骨髓等，优选地，从骨髓中获取间充 质干细胞。优选地，间充质干细胞的密度为5-15 X 106个/ml。 步骤二中，海藻酸盐高分子在除镁以外的二价金属离子的作用下交联而失去了流 变性后，水分子的流动受到了抑制，进而产生了含水量极高且具有通孔的凝胶体，并且海藻 酸盐的凝胶体不是热可逆的，具有很好的稳定性及生物相容性，因此，能够为间充质干细胞 提供稳定的三维生长空间，模拟细胞在体内的生长环境，扩大了间充质干细胞的生长空间， 并且增大了间充质干细胞与培养液的接触面积，有利于细胞的贴附、生长和分化；而本专利技术 在形成海藻酸凝胶球之前即将间充质干细胞与海藻酸盐混合，使得凝胶球形成之后，间充 质干细胞能够均匀分布在凝胶球中，更有利于间充质干细胞的培养。 需要注意的是，由于金属离子和海藻酸盐的反应迅速，可通过提高凝胶化温度，钙 离子总量或降低海藻酸盐溶液浓度来加快胶化过程；而减慢固化速度、提高海藻酸盐溶液 浓度、钙离子总量以及使用分子质量较高的海藻酸盐，可以增强其力学性能，更有利于间充 质干细胞的分化。另外，海藻酸盐与金属离子盐溶液的滴加顺序及滴加速度会影响胶体的 性质，滴加速度过快，产生的胶体是小片状凝胶和间断的凝胶结构，间充质干细胞分布不均 匀；优选地，本专利技术采用将间充质干细胞与海藻酸盐混合后匀速滴入金属离子盐溶液中，以 此形成的凝胶球大小较均匀，也不会影响间充质干细胞在胶体内的均匀分布。 其中，单价阳离子和Mg2+不能形成凝胶，而Ba2+和Sr2+所形成的凝胶比Ca 2+形成 的凝胶性能更强。其他多价阳离子，如Pb2+、Cu2+、Cd 2+、Co2+、Ni2+、Zn2+和Mn 2+等也可以形成 海藻酸钠交联凝胶，但因具有毒性其应用受限；因此，优选地，二价金属离子为钙离子，且二 价金属离子盐溶液为氯化钙溶液，〇 &(：12的浓度为1 % -5 % W/V，钙离子浓度越大，凝胶球直 径越大，形成的孔隙结构越多，凝胶球的渗透能力也越强，越本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种间充质干细胞的三维诱导培养方法，其特征在于，包括以下步骤：获取间充质干细胞；将间充质干细胞与可溶性的海藻酸盐混合后，再与除镁离子以外的二价金属离子盐溶液混合，至形成凝胶球；用诱导剂对凝胶球内的间充质干细胞进行诱导培养。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，鲁菲，
申请(专利权)人：深圳华毓造血干细胞研究有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44