本发明专利技术公开了一株可表达绿色荧光蛋白(GFP)的生防菌玫烟色拟青霉在靶标害虫流行病学中的应用。该生防菌通过原生质体转化技术，将带有绿色荧光蛋白标记的表达质粒载体pCT74-GFP转入玫烟色拟青霉菌株FZ01基因组中，获得了一株可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP。该菌株用于靶标害虫流行病学的研究：释放所述FZ01-GFP生防菌株，定时定点采集、记录靶标害虫数量，收集罹病害虫样本，通过质粒载体pCT74-GFP的一对特异引物对罹病样本进行PCR分子检测鉴别，分析数据，确定生防菌FZ01-GFP对靶标害虫侵染的发生规律和流行趋势。解决了目前生防菌流行病学研究中靶标害虫病因鉴定困难的问题。具有步骤简单，操作方便，能有效监测和客观反映生防菌玫烟色拟青霉对靶标害虫发生发展规律等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及农作物害虫病原真菌流行病学研究领域，特别涉及一种可表达GFP的 生防菌株玫烟色拟青霉FZ01-GFP在靶标害虫流行病学中的应用。
技术介绍
近年来，我国对农业有害生物的生物防治给以了极大的重视。但目前关于生防菌 的基础研究比较薄弱，特别是对靶标害虫病原性真菌的流行病研究还缺乏有效合理的技术 手段，这严重阻碍了生防菌的利用和发展。 玫烟色拟青霉（Paecilomycesfumosoroseus)属于半知菌纲，壳霉目、杯霉科。其 地理分布广泛，昆虫寄主多样，是蚜虫、粉虱等重要害虫的致病真菌。在自然条件下，可在 蔬菜、水果和园林植物等的靶标害虫种群中形成流行病。如在我国南方地区蔬菜植物上的 烟粉虱种群中可大面积地持续流行、能有效地控制烟粉虱种群的危害。在国外玫烟色拟青 霉已被开发为商品用于防治烟粉虱。然而，关于该生防菌对靶标害虫的侵染和流行病学研 究还是空白，最主要的就是无法简便、有效进行害虫病因的鉴别，特别是针对该属中某一特 定菌株的流行规律与控制评价，目前还缺乏快捷、可靠的技术进行大规模检测应用。
技术实现思路
本专利技术目的是针对目前温室害虫病原真菌流行病学研究中，现有技术无法对靶标 害虫致死病因进行有效、快捷、可靠鉴别分析，特别是对生防菌某一特定菌株的流行规律和 防控效果评价缺乏可实施的简单方法，提出了一种可表达GFP(绿色荧光蛋白）的FZ01-GFP 生防菌株及其应用。 本专利技术具体的技术方案如下： 本专利技术提供一种可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP，该生防菌株为采用原生质体的 遗传转化方法，将带有绿色荧光蛋白标记的表达质粒载体PCT74-GFP转入玫烟色拟青霉菌 株FZ01基因组中，获得可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP。 本专利技术还包括上述生防菌株FZ01-GFP在靶标害虫流行病学中的应用，具体过程 包括： 释放所述FZ01-GFP生防菌株，定时定点采集、记录祀标害虫数量，并收集罹病害 虫样本，通过质粒载体PCT74-GFP的一对特异引物对罹病样本进行PCR分子检测鉴别，分析 数据，确定靶标害虫发生规律和生防菌FZ01-GFP流行趋势。 其中，定时定点采集、记录靶标害虫数量，并收集罹病害虫样本的具体步骤为： 每处理固定5点，每点连续调查3株，总计15株番前，在早晨成虫不大活动时，检 查每植株3片叶片的背面，每周固定同一天调查虫口情况，记录靶标害虫数量，收集罹病害 虫样本； 优选的，在本专利技术中，对罹病样本进行PCR分子检测的特异引物如SEQIDN0. 1-2 所示： SEQIDNO. -TAGTGGACTGATTGGAATGCATGGAGGAGT-3r ； SEQIDNO. 2 :5' -GATAGAACCCATGGCCTATATTCATTCAAT-3'。 本专利技术中，PCR分子检测鉴别的具体步骤包括： (1)单头样品DNA提取； (2)PCR扩增：PCR反应体系20yl，包括2.Oyl10XPCR反应缓冲液，各0. 5yl 10ymol/L所述引物，和2y1模板DNA，ddH20补足20y1 ;PCR反应条件为：94°C预变性 2min;94°C变性 30sec，53°C退火 30sec，72°C延伸 40sec，共 33 个循环；72°C延伸 5min; (3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照，根据扩增产 物的有无和片段大小判定结果，进一步鉴定致死病因。 具体地，鉴定致死病因的标准为：特异性地扩增出417bp条带时，判断靶标害虫病 因为FZ01-GFP生防菌株侵染致死，无417bp条带则判断为非FZ01-GFP生防菌侵染。 本专利技术的关键性技术是采用原生质体遗传转化方法，将表达载体PCT74-GFP转入 玫烟色拟青霉菌株FZ01基因组中，获得了一株可表达绿色荧光蛋白的菌株（FZ01-GFP)。在 温室内通过特定时间进行菌株释放，经科学的采样方法，并以质粒特异引物对罹病样本病 因是否由FZ01-GFP菌株侵染所致可进行大规模的PCR分子检测鉴别，结果快捷、可靠。本发 明以2014年室内玫烟色拟青霉菌FZ01-GFP侵染试验所采集的烟粉虱50份罹病样本为供 试材料，对害虫病因是否为FZ01-GFP菌株侵染引起进行分析，按上述PCR体系和鉴定方法， 结果都能特异性地扩增出417bp目的条带，证实该方法可用于玫烟色拟青霉流行病学研究 中快速可靠的检测和鉴定。 本专利技术方法适用于玫烟色拟青霉流行病学研究中大量靶标害虫病因的快速鉴别， 对于生物防治中生防菌的流行病学研究和防控效果评价具有重要的实用价值。也可应用于 生防菌侵染机制、毒力效价评估、田间调查，为防治策略的制定提供科学依据。本专利技术与现 有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果： 1、特异性强，可靠性高：本专利技术分子PCR检测引物是以转化pCT74-GFP质粒为模 板，特异性强。已经对50个样本鉴定验证，结果证实所设计的两对引物特异性强，灵敏度 高，样品DNA含量lpg以上即可检测出。 2、简便快速，实用性强：应用本专利技术方法对烟粉虱DNA提取、PCR扩增和琼脂糖电 泳后即可判定结果，一般100个样品整个检测过程可在4小时内完成。本方法可满足大量 样品快速检测的需要。 3、适应性广、费用不高：本专利技术也可应用于侵染机制、毒力效价评估、田间调查等 领域。【附图说明】 图1玫烟色拟青霉FZ01在不同浓度潮霉素PDA生长情况； 图2玫烟色拟青霉FZ01原生质体形态； 图3玫烟色拟青霉FZ01-GFP孢子在光学显微镜（左）和荧光显微镜（右）的对 照图片； 图4玫烟色拟青霉FZ01-GFP菌丝在荧光显微镜的特征图片； 图5玫烟色拟青霉FZ01-GFP转化子基因组DNA扩增图，用质粒特异引物扩增出目 的片段在1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中：M为100bpDNAmarker;417bp为目的条 带； 图6GFP转化后玫烟色拟青霉（FZ01-GFP)侵染烟粉虱结果； 图7单季西红柿大棚玫烟色拟青霉FZ01-GFP对靶标害虫烟粉虱的流行趋势； 图8为不同浓度样品DNA的PCR检测扩增图；其中1-6DNA浓度分别为每微升分别 为 10,1，0. 1，0. 01，0. 001，0.OOOlng; 图9为部分烟粉虱罹病样品PCR扩增检测结果。【具体实施方式】 下面将结合本专利技术中的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地 描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施 例，都属于本专利技术保护的范围。 实施例1:玫烟色拟青霉菌株FZ01的GFP转化 1材料： 1. 1菌株和质粒 玫烟色拟青霉FZ01由本研究室2013年在福州东郊从野外烟粉虱罹病体内经 分离获得并保存。质粒PCT74-GFP由福建省农科院资源所惠赠，含有真菌Pyrenophora triticireperttis的ToxA启动子和潮霉素B磷酸转移酶基因（hygr)。 1. 2培养基、试剂和酶 1. 2. 1培养基LB培养基：酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaC15g、琼脂15g、水1000mL、 pH7. 0 ;PDB培养基：马铃本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可表达GFP的生防菌株FZ01‑GFP在靶标害虫流行病学中的应用，其特征在于，采用原生质体的遗传转化方法，将带有绿色荧光蛋白标记的表达质粒载体pCT74‑GFP转入玫烟色拟青霉菌株FZ01基因组中，获得可表达GFP的生防菌株FZ01‑GFP；所述FZ01‑GFP生防菌株应用于靶标害虫流行病学中的具体过程为：释放所述FZ01‑GFP生防菌株，定时定点采集、记录靶标害虫数量，收集罹病害虫样本，通过质粒载体pCT74‑GFP的一对特异引物对罹病样本进行PCR分子检测鉴别，分析数据，确定生防菌FZ01‑GFP对靶标害虫侵染的发生规律和流行趋势。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑宇，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35
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