生产连续细胞系的方法技术

本发明专利技术涉及生产连续细胞系的方法，所述方法包括提供动物或人类的活细胞，用UV光辐照所述细胞，增殖所述细胞，以及筛选增殖的细胞作为连续细胞系的细胞。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请是国际申请日2009年2月20日、国际申请号PCT/US2009/034732于2010 年8月25日进入中国国家阶段、申请号200980106313. 2、专利技术名称"生产连续细胞系的方 法"的申请的分案申请。 专利
本专利技术涉及生产细胞系的方法。 专利技术背景 细胞系已成为用于疫苗制造的有价值的工具。一些重要疫苗和病毒载体的生产仍 然在鸡胚或鸡胚原代成纤维细胞中进行。用于病毒复制的禽类原代组织由SPF(无特定病 原体）生产厂提供。SPF来源的组织昂贵，并且原料供应的质量通常难以控制。因此，供应 的不一致性和短缺是基于SPF蛋技术的最主要缺点。对于使用原代成纤维细胞单层培养物 的方法来说，同样也是这样。为了无限地增殖细胞系，需要将细胞永生化。目前使用的大多 数永生化细胞系是癌细胞或融合的杂交瘤细胞的后裔。但是，后一种技术受到与骨髓瘤细 胞融合的限制。不存在能够产生不同类型的永生化细胞的通用技术。 专利技术简沐 本专利技术的目的是从不连续的细胞材料生产连续细胞。具体来说，目的是提供不引 入外来病毒基因的具有增殖潜力的连续细胞系。 因此，本专利技术提供了一种用于，所述方法包括提供动物或 人类的活细胞，用紫外光辐照所述细胞，增殖所述细胞，以及选择在至少20次传代后能够 增殖的细胞作为连续细胞系的细胞。 这样的连续细胞系是能够增殖并用于生物分子例如蛋白质的重组表达，或用于制 造病毒产品例如病毒抗原或完整病毒群，特别是用于疫苗接种目的的细胞的培养物。 因此，本专利技术还提供了一种生产病毒的方法，所述方法包括提供可通过本专利技术的 方法获得的连续细胞系的细胞，用所述病毒感染所述细胞，在所述细胞中增殖所述病毒，以 及收集所述病毒。 另一方面，本专利技术提供了一种生产重组基因产物的方法，所述方法包括提供可通 过本专利技术的方法获得的连续细胞系的细胞，用编码所述基因产物的核酸转染细胞，表达所 述基因产物，以及任选地收集所述基因产物。 另一方面，本专利技术提供了可以通过一种方法获得的连续细胞系，所述方法包括提 供动物或人类的活细胞，用有效剂量的紫外光辐照所述细胞，增殖所述细胞，以及选择在至 少20次传代后能够增殖的细胞作为所述连续细胞系的细胞。【附图说明】 图1显示了 UV处理步骤的流程。 图2显示了鹌鹑的连续细胞培养物。 图3显示了生产鹌鹑连续细胞系的系统树以及处理路线。图4显示了采用用于生产连续细胞的设置，UV剂量与辐照时间的相关性。 专利技术详沐本专利技术提供了通过细胞的UV处理来生产连续细胞系。细胞系是由原代细胞培养物的一个或多个传代培养物形成的细胞群。每轮传代培 养被称为传代。当细胞被传代培养时，它们被称为已被传代。特定细胞群、或细胞系，可以 由它已被传代的次数来表征。原代培养物是细胞从组织分离后的第一代培养物。在第一 次传代培养后，细胞被描述为第二代培养物（一次传代）。在第二次传代培养后，细胞变成 第三代培养物（两次传代），依此类推。本领域技术人员将会理解，在传代期间可能存在多 次群体加倍；因此，培养物群体加倍的数量大于传代次数。传代之间的时间中细胞的扩增 (即群体加倍的数量）取决于许多因素，包括但不限于接种密度、基底、培养基、生长条件和 传代之间的时间。培养可以通过接种细胞培养基，使细胞生长至细胞形成汇合细胞培养物 或连续的膜，并用一部分汇合细胞接种新的细胞培养基来进行。然而，传代是评估增殖能力 的工具。一般来说，从组织分离到的细胞、包括未辐照细胞，在它们达到不发生进一步增殖 或细胞加倍的状态之前，能够传代约10-20次。然后细胞进入衰老状态，不能从其获得进一 步的传代培养。与此相反，连续细胞系在20次以上传代之后、例如在22、24、26、28、30、32、 34、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75或80次以上传代之后能够增殖。现在，本 专利技术人已经发现，这种在第20次传代后能够传代多次的连续细胞、特别是永生化细胞，可 以通过用UV处理改变细胞、即通过用有效剂量的UV光辐照这些细胞来获得。本专利技术的术 语"有效剂量的UV光"是将非连续细胞系转化成连续细胞系所需的辐照的量。有效剂量的 UV光的范围，从这种转化所必需的最小剂量直到这些细胞所耐受的对细胞培养物整体没有 致死结果的最大剂量。显然，高于或低于有效剂量限度，不能获得连续细胞系。本领域技术 人员在本文中获得的信息和指导的基础上，经常规的最适化过程就能容易地确定每个细胞 系的最适有效剂量。细胞可以是原代细胞或几次传代后能够增殖的细胞。细胞系的培养可 以使用标准的细胞培养技术来进行，例如在T型瓶系统或转瓶系统中，或在搅拌釜或其他 生物反应器形式中。在本专利技术的几种实施方案中，培养物适合于并保持在无血清条件下。 在本申请中，术语"UV光"是指波长从10到400nm、特别是100到400nm的紫外辐 射。UV 光可以选自 UV C(100 到 280nm)、UV B(280 到 320nm)和 UV A(320 到 400nm)。在本 专利技术的某些实施方案中，波长在200到300nm之间。可以使用光敏剂例如嵌入到DNA中并 被UV光活化的光敏剂来加速UV辐照的改变效应，尽管它们在本专利技术的所有实施方案中不 是必需的。在本专利技术的一个实施方案中，UV光是波长为约100到约280nm的UV C。在本发 明的另一个实施方案中，UV光具有约240到约290nm的波长。在本专利技术的另一个实施方案 中，约85%或85%以上的群光具有约25411111的波长。 不受任何理论的束缚，据信UV光改变细胞的遗传物质，这引入了突变。尽管这样 的改变一般能够被细胞的修复机制修复，但某些改变可能保留。这些改变能够引入致死突 变以及导致细胞永生化的变化。从UV辐照实验，可以选择导致显著部分的细胞永生化并能 够培养的最适剂量。在传代后，据信只有能够增殖的活细胞被选择，预计它们仅具有少量变 化，其中至少一个变化导致了永生化。显著部分的被辐照细胞将不被永生化而是获得了不 同的变化，产生凋亡或坏死的细胞。但是，原则上说，对于获得连续细胞培养物来说，仅仅一 个具有诱导永生化的变化的细胞就已足够，因为该细胞将通过本文描述的多轮传代继续增 殖和存活。 UV光发射可以是连续形式的UV光发射例如汞灯技术，或脉冲式UV光例如单色激 光技术。所需UV强度可以通过组合两个或以上灯来产生。至少两个辐照步骤可以组合，其 间具有暂停。本专利技术的主题包含任何有效剂量的UV光，即使细胞改变成连续增殖的任何剂 量的UV光。有效剂量可以依赖于各种不同的本
所公知的因素，例如UV辐照室的 物理参数，例如灯和室的尺寸和直径、包含细胞的培养基与UV光源之间的距离、室的材料 的光吸收和反射性质。在本专利技术的具体实施方案中，细胞以单层、表面上的一个细胞层的形 式被辐照。同理，UV光的波长和强度以及细胞暴露于UV光的接触时间对于有效剂量来说也 是关键的。此外，有效剂量还受细胞自身、含有病毒的培养基及其光吸收性质的影响。在本 专利技术的各种不同实施方案中，有效剂量足以改变样品中包含的至少20 %、30 %、40 %、50 %、 60 %、70 %、80 %、90 %或100 %的细胞，在其他实施方案中，有效剂量足以将细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于将禽类细胞永生化的方法，所述方法包括：用波长在200nm到300nm之间且剂量为约20mJ/cm2到约105mJ/cm2的UV光辐照分离的禽类原代细胞，其中辐照时间为30秒到4分钟；以及选择增殖至少20代的细胞作为永生化细胞。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：曼弗雷德·赖特尔，沃尔夫冈·蒙特，西蒙·费格尔，西蒙·冯菲尔克斯，
申请(专利权)人：巴克斯特国际公司，巴克斯特医疗保健股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US