一种基于SSCP的基因组定向修饰检测方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种基于SSCP的基因组定向修饰检测方法。本发明专利技术要解决的技术问题是为定向修饰位点的检测提供一种新选择。本发明专利技术的技术方案是一种基于SSCP的基因组定向修饰位点检测方法，包括如下步骤：a、获得包含定向修饰位点的基因组DNA片段；b、将步骤a获得的片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。本发明专利技术方法适用于大批量样品的检测，可用于定向修饰突变后的初步筛选。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种基于SSCP的基因组定向修饰 检测方法。
技术介绍
随着一系列序列特异性核酸酶例如ZFN、TALEN以及CRISPR/Cas9等的出现，使得 基因组定向修饰技术的发展越来越快。通过它们可以在目标基因组特定位点修饰位点处 通过的高效的特异性剪切，诱导实现DNA双链断裂，引发容易产生错配修复的非同源末端 连接（non-homologous end joining, NHEJ)修复或者更为精确的同源重组同源定向修复 (homologous recombination, HR)机制，从而实现针对特定位点的基因修饰。 目前，已经有多种检测基因组定向修饰的方法被开发出来。最常用的方法包括 利用SURVEYOR、CEL-I或T7E1核酸酶特异性剪切核酸双链错配位点的异源双链分析法 (hetero-duplex analysis)、聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP)分析和高 分辨率融化曲线（HRM)分析等。但这些检测基因组定向修饰的方法在使用中有很多局限 性。它们或者需要在定向修饰位点处存在合适的酶切位点；或者无法产生可用于测序的 突变DNA片段；或者无法区分异源多倍体动植物中天然存在的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP)位点。因此寻找更合适的定向修饰位点检测方法具有十 分重要的意义。 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP)分析是一 种简单、灵敏的点突变检测方法。它的基本原理是利用单链DNA序列中碱基的变化来改变 单链DNA特定的构象，引发其在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迀移率发生变化。因此可 以通过电泳产生的不同带型来区分野生型和突变型的DNA单链。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是为定向修饰位点的检测提供一种新选择。 本专利技术的技术方案是一种基于SSCP的基因组定向修饰位点检测方法，包括如下 步骤： a、获得包含定向修饰位点的基因组DNA片段； b、将步骤a获得的片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述聚丙烯酰胺凝胶浓度为 8~15%，丙烯酰胺Acr/甲叉丙烯酰胺Bis质量比为19 :1或29 :1。 具体的，步骤a中所说的DNA片段长度200~400bp。DNA片段太长或太短会使其 检测灵敏度下降。 具体的，步骤b中所述的聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%或12%，其胶配比Acr/Bis的 质量比为19 :1。 具体的，步骤b中所述的聚丙烯酰胺凝胶浓度为15%，其胶配比Acr/Bis的质量比 为 29 :1。 具体的，步骤b中电泳温度为4°C。 具体的，步骤b中电泳时间为4~6小时。 具体的，步骤b中所述电泳恒压180V或恒流为45mA。 优选的，聚丙烯酰胺凝胶浓度为15%，其胶配比Acr/Bis的质量比为29 :1，4°C， 45mA下电泳4~6小时。 最优选的，聚丙烯酰胺凝胶浓度为15%，其胶配比Acr/Bis的质量比为29 :1，4°C， 45mA下电泳4~6小时；或者聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%或12%，其胶配比Acr/Bis的质 量比为19 :1，4°C，180V下电泳4~6小时。 具体的，步骤b中加入样品电泳前进行预电泳，即采用正式电泳的电流和电压电 泳20~30分钟。 本专利技术所述的实现物基因组定向修饰突变位点的检测方法，是利用单链构象多态 性（SSCP)的基本原理进行的。所述基本原理是利用单链DNA序列中碱基的变化来改变单 链DNA特定的构象，不同的构象在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迀移率不同。从而来区分野生 型和突变型的DNA单链。 本专利技术的有益效果：本专利技术检测方法操作简单，准确率高；DNA样品中，突变型占 比达到10%及以上，即可进行有效检测。该方法适用于大批量样品的检测，可用于定向修饰 突变后的初步筛选。【附图说明】 图1为PCR-SSCP检测体系的建立。其中图la为pBluescriptII系列缺失载体 (由从1个碱基缺失到9个碱基的缺失质粒组成，即A 1，A 2,……，A 9)。缺失位点通过 引物M13F和M13R进行PCR获得；图lb为pBluescriptII删除系PCR产物经95°C变性5 分钟后，在聚丙烯酰胺凝胶浓度15 %，其胶配比Acr/Bis为29: 1，45mA恒电流，4°C情况下 电泳6h的电泳图。"Serial nucleic acid change"表示核酸改变系，"WT"表示未突变的 DNA 序列，"M13F，M13R"表示 PCR 扩增用引物，"M"表示 marker，"A 1，A 2,......，厶9"表 示从1个碱基缺失到9个碱基的DNA序列。 图2为PCR-SSCP检测体系的灵敏度测试。其中图2a为一个碱基缺失载体 pBluescript II A 1与野生型 pBluescript II WT 用引物 M13F，M13R进行 PCR 的产物 不同比例的混合样电泳；图2b为为两个碱基缺失载体pBluescript II A 2与野生型 pBluescript II WT用引物M13F，M13R进行PCR的产物不同比例的混合样电泳。显示突变 型占比达到10%及以上，即可进行1个碱基差异的有效检测。 图3为CRISPR_Cas9表达质粒pZDW004转化水稻原生质体转化得到的OsDEPl基 因定向修饰原生质体样品的SSCP分析图。其中，"M"表示marker，"WT"表示野生型，" 1"表 示Cas9定向修饰DEP1稳定转化原生质体。 图4为水稻农杆菌介导稳定转化OsDEPl基因突变体T0代单株检测结果图。其中 图4a为OsDEPl基因定向突变位点PCR产物Mfel酶切鉴定结果图；图4b为OsDEPl基因定 向突变位点PCR产物SSCP鉴定结果图。其中，"M"表示marker，"WT"表示骨架载体转化T0 代植株，"28-40"表示Cas9定向修饰DEP1稳定转化TO单株编号。 图5为OsDEPl基因突变位点（即基因同源重组）PCR扩增产物测序结果图。其 中，"WT"表示野生型基因序列，表示发生了删除突变的序列，" + "表示发生了插入突 变的序列，后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量，"#"表示突变体单株编号， "Reference"表示野生型OsDEPl基因在该位置的DNA序列，"Locus"表示突变体OsDEPl基 因在该位置的DNA序列。【具体实施方式】 实施例1采用缺失载体进行检测 l、pBluescript II缺失系载体构建 为了验证SSCP系统能否有效地检测小片段的缺失与突变，本专利技术采用2013年 日本研究学者所构建的pBluescript II不同长度片段缺失载体作为检验体系的基本载体 (该载体系由日本理化研究所定量生物学研究中心Atsuo Kawahara教授惠赠）。本缺失 载体系统对pBluescript II骨架载体多克隆位点区域的EcoR I和Xba I两个酶切位点之 间的序列设计了 l_9bp的片段缺失，分别合成含有l-9bp碱基缺失的目的片段正义链与反 义链（表1)，取15yL对应的正向引物和反向引物（1μg/μL)分别混勾，98°C变性3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于SSCP的基因组定向修饰位点检测方法，其特征在于：包括如下步骤：a、获得包含定向修饰位点的基因组DNA片段；b、将步骤a获得的片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述聚丙烯酰胺凝胶浓度为8～15％，丙烯酰胺Acr/甲叉丙烯酰胺Bis的质量比为19：1或29：1。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑雪莲，周建平，张勇，邓科君，杨仕鑫，章登位，
申请(专利权)人：电子科技大学，
类型：发明
国别省市：四川;51