皮质醇免疫原、衍生物、抗体、检测试剂及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种皮质醇免疫原、衍生物、抗体、检测试剂及制备方法。本发明专利技术制备的皮质醇免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗皮质醇特异性抗体，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；由该抗体制备得到的皮质醇检测试剂，可以精确快速地确定尿液、血清、血浆等生物样品中的皮质醇含量。与市场上现有的检测试剂比较，本发明专利技术检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低皮质醇检测成本，有利于临床大规模推广使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及皮质醇免疫原、衍生物、抗体、检测试剂及制备方 法。
技术介绍
皮质醇（Hydrocortisone)，其结构式如式（III)所示： 皮质醇又称氢化可的松，是肾上腺在应激反应中产生的一种留体类激素。皮质醇 是主要的糖皮质激素，参与人体内性激素代谢，并能影响机体糖、脂肪、蛋白质的代谢以及 调节机体中水、电解质平衡等一系列生命活动。人体每日分泌皮质醇总量约为200mg，且分 泌量根据每日时辰（24h)呈现明显的周期性变化。皮质醇分泌进入血液后，绝大部分与类 固醇激素结合球蛋白（CBG)结合。血液中游离的皮质醇只占皮质醇总量的1%-3%，但只 有游离的皮质醇才具有生物活性。通常游离皮质醇与结合皮质醇保持相对平衡，但在机体 创伤、感染、运动、情绪激动等情况下其含量均有显著升高，肾上腺分泌皮质醇机能亢进或 者低下也会产生特征性的临床表现。因此，在当前临床医学和药物学研究及实践中，测定皮 质醇的水平已成为一项重要的指标。目前，皮质醇的检测方法主要包括：高效液相色谱法（HPLC)、液相色谱串联质谱 联用法（LC/MS/MS)，放射免疫分析法（RIA)、化学发光免疫分析法（CLIA)和酶联免疫分析 法（ELISA)等。这些检测方法各有其优劣之处，但是在临床大规模应用上都有一定的局限 性。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的皮质醇检测试剂，尤其是质量好的自 动化检验试剂，因此，研发一种质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生 化分析仪的皮质醇测定试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术存在的缺陷，采用独特的皮质醇衍生物制备免疫原性强 的皮质醇免疫原及其抗体，用该抗体制备的皮质醇均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动 生化分析仪上对皮质醇高通量、快速化的检测。该检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异 性强、结果准确等优点，还能有效降低皮质醇检测成本，有利于临床推广使用。 本专利技术的一个目的在于提供一种免疫原性强的皮质醇免疫原。 本专利技术的又一个目的在于提供一种用于形成皮质醇免疫原的皮质醇衍生物。 本专利技术的另一个目的在于提供一种皮质醇免疫原的制备方法。 本专利技术的又一个目的在于提供使用本专利技术皮质醇免疫原制备得到的特异性强的 抗皮质醇特异性抗体。 本专利技术的再一个目的在于提供一种皮质醇检测试剂及其制备方法。 本专利技术的皮质醇免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗皮质醇特异性抗 体。该抗体特异性高，与皮质醇的结合力强。由该抗体制备得到的皮质醇检测试剂，可以快 速、准确地确定样品中的皮质醇含量。本专利技术是通过以下技术方案实现的： 一种皮质醇免疫原，其结构式如式（I)所示： 载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、血蓝蛋白和甲状腺球蛋白 的一种。更优选为血清白蛋白，进一步优选为牛血清白蛋白。 所述的皮质醇免疫原由皮质醇衍生物与上述载体连接而成。一种皮质醇衍生物， 其化学结构如式（II)所示： 皮质醇免疫原的制备方法，包括以下步骤： (1)将载体蛋白100~300mg溶解于25~75ml0? 2M，pH8. 5的磷酸缓冲液中； (2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100~300mg皮质醇衍生物、1. 75~ 5. 25ml二甲基甲酰胺、1. 75~5. 25ml乙醇、3. 5~10. 5ml10mM，pH5. 0的磷酸钾缓冲液、 100~300mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基）碳二亚胺、25~75mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺， 将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30~60min; (3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2~8°C下搅拌过夜，得到抗原； 将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到皮质醇免疫原。 -种抗皮质醇特异性抗体，为由皮质醇免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分 子，或者为保留与皮质醇特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。 所述的完整的抗体分子、抗体片段或抗体衍生物，为采用单一的皮质醇免疫原对 动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述 的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马的一种。优选为兔。 所述的抗皮质醇特异性抗体由上述制得的皮质醇免疫原采用常规方法接种实验 动物，加强免疫后取抗血清。抗皮质醇特异性抗体的制备方法，包括以下步骤： (1)用PBS将上述合成的BSA-皮质醇免疫原稀释至0? 1~3.Omg/ml，得到抗原溶 液，然后用0. 5~5. 0ml抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射； (2)2~3周后，再用0. 5~5. 0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述 实验动物注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射3~6次； (3)对上述实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000~1:50000的抗皮质醇特 异性抗体。 -种皮质醇检测试剂，含有所述的抗皮质醇特异性抗体和指示试剂，所述的指示 试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或发光试剂中的一种；所述的酶试剂由皮质 醇酶标偶联物和酶的底物组成，酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物， 酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。 -种皮质醇检测试剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤： (1)试剂A:将2. 018~8. 072g、5. 625~22. 50mM氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸和 0? 856 ~3. 422g、5. 625 ~22. 50mM葡萄糖-6-磷酸用 0? 5 ~2L55mM、pH= 8. 0 的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将所述的抗皮质醇特异性抗体加到上述均相酶底物中， 抗皮质醇特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:100~1:10000 ; ⑵试剂B:将皮质醇酶标偶联物加到120mM、pH= 8. 2的Tris缓冲液中，皮质醇 酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100~1:10000。 所述的抗皮质醇特异性抗体与均相酶底物的体积比优选为1:500; 所述的皮质醇酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比优选为1:2500。 所述的皮质醇酶标偶联物的制备方法包含以下步骤： (1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：称取7. 5~22. 5mg规格为100KU的葡 萄糖_6_磷酸脱氢酶，室温溶解于6~18mL含有72. 6mg0. 05MTris、8mg3. 3mMMgCl# lOOmgNaCl的溶液中，pH= 9. 0 ;在溶液中加入112. 5~337. 5mg还原态的烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸、67. 5~202. 5mg葡萄糖-6-磷酸以及0. 375~1. 125mL卡必醇；再逐滴加入1~ 3mL二甲基亚砜； (2)皮质醇衍生物的激活：在无水状态下称取5~15mg皮质醇衍生物，溶解于 300~900yL二甲基甲酰胺中；使上述溶液温度降到-2~-8°C;加入1. 5~4. 5yL三丁 胺；加入0. 75~2. 25yL氯甲酸异丁酯；-2~-8°C搅拌30~60分钟； (3)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与皮质醇衍生物的连接：将步骤⑵激活的皮质醇衍 生物溶液逐滴加入到步骤（1)溶解的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2_8°C搅拌过夜； (4)纯化产物：通过G-25本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种皮质醇免疫原，其结构式如式(Ⅰ)所示：载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的一种。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：虞留明，杨晓莉，郝钦芳，
申请(专利权)人：苏州博源医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32