本发明专利技术涉及一株用于生产l‑天冬酰胺的基因工程菌CICC 11034S，宿主为大肠埃希氏菌BL21(DE3)（Escherichia coli BL21(DE3)），含有来源于大肠埃希氏菌JM109（Escherichia coli JM109）的l‑天冬酰胺合成酶基因的表达载体。利用构建的工程菌全细胞高密度催化，可以高效转化l‑天冬氨酸生产l‑天冬酰胺，转化率为95.8%，l‑天冬酰胺产量可达126.5 g/L，生产速率为15.81 g/(L·h)，底物廉价，生产过程简便，副产物少，有效降低生产成本，具有很好的应用价值和可观的经济效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株基因工程菌及其应用，以1-天冬氨酸和氨水为底物转化生产1-天冬酰胺，属于生物工程
技术介绍
1-天冬酰胺，又名天门冬酰胺、天门冬素、α -氨基丁二酸一酰胺(L-Asparagine，1-Asn)，在食品、医药、化工合成等行业得到广泛应用。在食品领域，1-天冬酰胺作为添加剂，与糖共热进行氨基-羰基反应，能形成特殊香味物质。用于清凉饮料。在医药行业，可以用于氨基酸输液及降压、平喘、抗消化性溃疡、胃功能障碍等，在生命科学领域研究中，常用于治疗心肌梗死、心肌代谢障碍、心力衰竭、心脏传导阻滞、疲劳等症，在微生物培养中也有添加。工业领域1-天冬酰胺可以用于医药中间体及化工原料进行合成化工，也可用于丙烯腈的污水处理等。目前，1-天冬酰胺的制备方法主要是提取法和化学合成法。直接提取方法主要是从1-天冬酰胺含量高的羽扇豆和大豆的豆芽的水提取物分离而得，以白羽扇豆为原料，经发芽、成浆、加热处理等流程，在PH小于6的条件下，经硅藻土过滤、离心，获得粗品，随后经过浓缩、结晶获得成品，该方法受原材料质量因素影响大，并且工艺复杂不易控制，污染严重；化学合成法主要通过1-天冬氨酸与氢氧化铵进行酰胺化而得，化学方法存在普遍的污染大、副反应多等缺陷。生物转化法在天冬酰胺生产领域的应用鲜有报道，虽然该方法具有反应条件温和、生产效率高、副产物少等优点，同时对设备的要求低、投资小、生产过程简单，易于操作控制，但是由于酶法催化过程需要ATP的参与，因ATP价格昂贵限制了生物转化法的应用，目前未进入产业化阶段。
技术实现思路
本专利技术提供一株可以表达1-天冬酰胺合成酶的基因工程菌株CICC 11034S，利用菌体细胞ATP再生体系，转化1-天冬氨酸和氨水生产1-天冬酰胺，以替代现有1-天冬酰胺生产工艺，实现绿色生产。本专利技术成功实现了将asW基因在S cWi BL21(DE3)宿主菌中的高效表达，并以此基因工程菌株转化1-天冬氨酸和氨水生产1-天冬酰胺，具有原料成本低、生产过程简易、简便高效等特点(附图1)。本专利技术底物1-天冬氨酸及产物1-天冬酰胺的定量测定分析采用柱前衍生-高效液相色谱方法(Hender Jff, et al., Rapid, accurate, sensitive and reproducibleHPLC analysis of amino acids.Agilent Technologies.USA.2000)。本专利技术具有的突出特点是:(I)本专利技术通过菌体细胞的ATP再生系统为反应提供ATP，有效降低了原料的成本。(2)本专利技术方法构建的基因工程菌生产1-天冬酰胺的过程简便，易于操作。(3)本专利技术的基因工程菌生产1-天冬酰胺，转化率为95.8%，产量可达126.5 g/L,生产速率 15.81 g/(L*h)。(4)本专利技术方法构建的基因工程菌可用于DL-天冬氨酸的拆分，生产1-天冬酰胺和D-天冬氨酸。【附图说明】图1工程菌CICC 11034S转化1-天冬氨酸生产1_天冬酰胺示意图。图2工程菌CICC 11034S全细胞高密度转化1_天冬氨酸生产1_天冬酰胺。【具体实施方式】实施例1.菌株方.coJi BL21(DE3)/pET28a-asa4的构建 利用天根基因组提取试剂盒提取E.coli JM109的基因组DNA，以其为模板，以引物AsnAU(5’-GCC GAA TTC ATG AAA ACC GCT TAC-3’，携带方coRI 酶切位点)和 AsnAD(5’_GTTAAGCTT TTA CAG CAG AGA AGG GAC-3’，携带历.Λ?/ III酶切位点)扩增asW基因。随后以EcoKl/Hindlll同时酶切处理扩增的asW基因和pET28a(+)载体，纯化后采用T4 DNA连接酶连接，转化S coli BL21 (DE3)，挑取转化子，鉴定、测序，获得基因工程菌株，命名为Acoli BL21(DE3)/pET28a-a仰儿于 CICC 保藏，保藏号:CICC 11034S。实施例2.基因工程菌CICC 11034S的发酵 将基因工程菌接种到发酵培养基(I L水中加入玉米浆干粉10 g，硫酸镁0.2 g，磷酸二氢钾1.0 g，氯化钠1.5 g，氨水调节pH 6.5 -7.5，卡那霉素0.05 g)中，37± 1°C摇床培养12±2 h，获得种子液。随后将种子液以0.1-5%接种量转接到发酵培养基中，37±1°C，220rpm培养2-3 h后加入2 g/L乳糖，20-25 0C, 160 rpm诱导表达12±2 h，获得发酵液。实施例3.基因工程菌CICC 11034S全细胞高密度转化生产1_天冬酰胺 L-天冬氨酸 0.8-1.2 M，以氨水调 pH7-9，葡萄糖 0.01-0.03 M(或 0.8-1.2 M ATP)，氯化镁1-3禮，菌体浓度为0D6QQnni=5-20，25-50°C，30-80 rpm搅拌催化6-12 h，定时取样采用柱前衍生-HPLC方法检测1-天冬氨酸和1-天冬酰胺，筛选优选条件。随后采用优选条件，将133 g L-天冬氨酸加入转化罐中，加入800 mL的水，然后边搅拌边加入氨水，并以pH计测定溶液PH变化情况，待L-天冬氨酸完全溶解，再以氨水调节pH为8.0，加入终浓度0.02M葡萄糖，2 mM氯化镁，定容I L。将发酵液离心收集菌体，生理盐水悬浮后，加入L-天冬氨酸溶液中，至菌体密度0D_nni = 10调节温度37°C，转速50 rpm，以HPLC定量检测不同时间1-天冬氨酸和1-天冬酰胺，催化反应8 h，转化率95.8%，1-天冬酰胺的产量可达126.5g/L，生产速率15.81 g/L (附图2)。实施例4.基因工程菌CICC 11034S全细胞高密度拆分Dl-天冬酰胺 采用实施例3优化的最佳转化条件进行DL-天冬氨酸的拆分，D-天冬氨酸保留率为100%，L-天冬氨酸转化率为93.2%。【主权项】1.本专利技术公开一株基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28-a5^ CICC 11034S。2.如权利要求1所述基因工程菌株，是一株用于生产1-天冬酰胺的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是含有1-天冬酰胺合成酶基因载体pET28-am儿宿主为方.coli BL21(DE3)，asW来源于E.cWi JM109或者其他能够表达相同功能酶的微生物。3.如权利要求2所述基因工程菌，其特征在于，可以高效表达1-天冬酰胺合成酶，并转化1-天冬氨酸生产1-天冬酰胺；转化体系以氨水调PH7-9，葡萄糖0.01-0.03 M (或0.8-1.2 M ATP)，氯化镁 1-3 mM，1-天冬氨酸0.8-1.2 M，菌体浓度为 0D6QQnni=5-20，25_50°C，30-80 rpm 揽摔，转化 6_12 h。4.如权利要求3所述转化过程，优选体系为pH8.0，葡萄糖0.02 M，氯化镁2 mM，1-天冬氨酸M，菌体浓度OD6tm=1,优选转化条件为37 0C, 50 rpm, 8 h。5.如权利要求3所述转化过程，葡萄糖通过活菌体细胞ATP再生系统产生ATP，为L-天冬酰胺合成酶转化1-天冬氨酸生产1-天冬酰胺提供A本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术公开一株基因工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28‑asnA CICC 11034S。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程池，张奇，徐友强，裴疆森，李金霞，刘波，
申请(专利权)人：中国食品发酵工业研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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