本发明专利技术的领域涉及一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法，其具体为，超滤并浓缩肺炎链球菌溶解产物，加入脱氧胆酸钠，调节pH至4-5，离心处理取上清液,加入核酸酶反应3-8小时,得到酸化溶解产物,加入脱氧胆酸钠，超滤酸化溶解产物,酸化后离心处理取上清液；超滤浓缩获得纯化多糖溶液多糖。该方法未使用苯酚及乙醇干燥后得到纯化的肺炎链球菌荚膜只使用一次核酸酶处理细胞溶解产物，产品更安全环保，工艺时间短，生产成本低，可实现大规模生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术的领域涉及，尤其涉及一种简化的纯 化方法。
技术介绍
肺炎链球菌是呼吸道感染的首要致病菌，既是引起儿童社区获得性肺炎最常见的 病原菌，也是致使老年人致命性肺炎感染的主要病原菌。目前发现90余个血清型，其中约 30个血清型的菌株对人类有致病性。荚膜多糖是肺炎链球菌的主要毒力因子，研究结果表 明肺炎链球菌荚膜多糖疫苗具有良好的免疫原性和安全性。制备肺炎链球菌荚膜多糖疫苗一般过程为：细菌在发酵罐中生长，在发酵结束时 通过加入脱氧胆酸钠或者另外的裂解剂诱导裂解。然后收获裂解物以进行下游的纯化并回 收围绕细菌细胞的荚膜多糖。所述多糖包含于最终的疫苗产物中，并赋予疫苗靶向群体对 于选定的肺炎链球菌血清型的免疫力。 在发酵培养过程中，除了产生荚膜多糖之外，还产生大量的蛋白质、核酸等成分， 当疫苗中含有这些成分且含量超过一定标准时，接种后可能导致较严重的副反应。《欧洲药 典》肺炎链球菌荚膜多糖疫苗规程对荚膜多糖中的蛋白质含量、核酸含量和特异多糖含量 有严格的要求。 肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法已有诸多报道和研究，但仍存在一些不足。例如， EP8026320中描述了一种经典的肺炎链球菌荚膜多糖纯化方法，即肺炎链球菌发酵培养液 经脱氧胆酸钠裂解后，离心超滤浓缩，用乙醇进行两步分级沉淀，再用苯酚抽提法去除蛋白 质，用活性炭吸附法去除核酸。该方法步骤繁琐，耗时较多，所用试剂中含有有毒的苯酚，对 人体及环境均有危害。另外，乙醇的使用在操作和试剂保存方面均存在重大安全隐患。US4242501、US4686102将此方法进行了改进，用溴化十六烷基三甲铵 (CTAB)替代了苯酚，但仍然没有避免乙醇的使用。US20100129881和NormaSuarez 等人（NORMASUA，REZ,LAURAFRANCO,etal.，FRAGUASAPPLIEDANDENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2001，p. 969 - 971Vol. 67,No. 2)，在肺炎链球菌荚膜多糖纯化工艺中引 入了柱层析的方法，但该方法对操作人员的要求较高，样品处理时间较长，且设备的运 行及维护费用高昂，很难满足大规模生产的需求。CA1206905提出了酶解法纯化肺炎 链球菌荚膜多糖，VivianeMaimoniGOftQalveS(VivianeMaimoniGor^alves,et al. ,Simpleandefficientmethodofbacterialpolysaccharidespurification forvaccinesproductionusinghydrolyticenzymesandtangentialflow ultrafiltration,CommunicatingCurrentResearchandEducationalTopicsand TrendsinAppliedMicrobiology, 2007, 1 (13) :450 - 457；VivianeMaimoniGongaives； etal. ,PurificationofCapsularpolysaccharidesformstreptococcuspneumoniae serotype23Fbyaproceduresuitableforscale-up,Biotechnol.Appl. Biochem.，2003, 37(3) : 283 - 287)等人，又做了一些改进，但这些方法均需使用多种核酸 酶、蛋白酶，步骤较多，成本较高，而且仍需乙醇分级沉淀处理，存在安全隐患。
技术实现思路
本专利技术针对以上问题，提供了一种更为简单，成本更低的纯化方法。 本专利技术的在于提供，其含有以下步骤： (a)细胞裂解 提供包含可产生选定肺炎链球菌血清型的细菌细胞的发酵培养液； 加入脱氧胆酸钠溶解所述步骤中的细菌细胞，由此产生包含细胞碎片、可溶蛋白、 核酸和多糖的细胞溶解产物；使用离心处理细胞溶解产物，取上清； 对上清液进行超滤浓缩，以去除低分子量杂质并浓缩，由此产生第一澄清细胞溶 解产物； (b)脱氧胆酸钠处理 在步骤（a)第一澄清细胞溶解产物中加入脱氧胆酸钠，并将pH降低至4-5以使蛋 白质和/或核酸沉淀，离心处理取上清液，得到酸化溶解产物； 重复1-2次，获得进一步纯化的酸化溶解产物； 对进一步纯化的的酸化溶解产物进行超滤浓缩，以去除低分子量杂质并浓缩，以 获得第二澄清细胞溶解产物； (c)核酸酶处理 使用核酸酶处理所述步骤（b)中的第二澄清细胞溶解产物； 在核酸酶处理的细胞溶解产物中加入脱氧胆酸钠，并将pH降低至4-5以使蛋白质 和/或核酸沉淀，离心处理取上清液； 对上清液进行超滤浓缩，以去除低分子量杂质并浓缩，从而获得纯化多糖溶液。 其中，前述纯化多糖溶液可通过干燥步骤进行干燥，所述的干燥步骤可为包括喷 雾干燥、流化床（fluidizedbed)干燥、转鼓式干燥、真空冷冻干燥在内的常见干燥方式，但 是出于便捷、以及纯化多糖溶液的稳定性考虑，优选地采取真空冷冻干燥。 其中，前述步骤（a)，（b)，（c)中的超滤浓缩是指用截留分子量为100Kd_300Kd的 超滤膜超滤浓缩。 其中，前述步骤（a)中的脱氧胆酸钠为终浓度为0. 05-0. 2%的脱氧胆酸钠，前述 步骤（b)，（c)中的脱氧胆酸钠为终浓度为0. 2-3%的脱氧胆酸钠。需要说明的是，由于在步 骤（b)中，脱氧胆酸钠的添加量可能分多次重复加入，而此处说明的终浓度含量，是在多次 重复添加后的最终浓度含量，且该浓度百分比为质量百分比。 其中，前述步骤（a)中的脱氧胆酸钠的处理时间为12-15小时，温度为18~22°C; 所述步骤（b)，（c)中的脱氧胆酸钠处理时间为8-15分钟，温度为18~22°C。 其中，前述步骤（a), (b)，（c)中的离心过程中的离心力为6000g，离心时间为15~ 35分钟。 其中，步骤（c)中的核酸酶为脱氧核糖核酸酶I(Sigma公司，货号：DN25,批号： SLBC4924V)〇 其中，步骤（c)中的核酸酶处理还混合有CaCl2,MgCl2。 其中，步骤（c)中的核酸酶处理时间为3-8小时，温度为35_37°C。 本方法的优势为：1.避免苯酚的使用，产品更安全环保；2.无乙醇的纯化工艺，消 除了安全隐患；3.只使用一次核酸酶，缩短了工艺时间，降低了生产成本；4.工艺操作简 便，可实现大规模放大。 下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料或生 物制剂，如无特殊说明，均为可从市场上购得的常规试剂。以下实施例中的定量实验，均设 置三次重复实验，结果取平均值。【具体实施方式】 实施例1 :1型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化 1型肺炎球菌发酵培养液5L，加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.15%，置于室温下 裂解12小时。随后将裂解液离心（离心力：6000g，离心时间：35分钟），收取上清液。随 后将该上清液通过l〇〇Kd膜包超滤浓缩至1000ml。加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0. 5%， 调口11至4.4，室温静置10分钟，进行离心（离心力：600(^，离心时间：15分钟），收集上清 液。随后重复前述步骤，再加入0. 5 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种自肺炎链球菌中纯化荚膜多糖的方法，所述方法包含以下步骤：(a)细胞裂解提供包含可产生选定肺炎链球菌血清型的细菌细胞的发酵培养液；加入脱氧胆酸钠溶解所述步骤(a)中的细菌细胞；使用离心处理细胞溶解产物，取上清液；对上清液进行超滤浓缩，由此产生第一澄清细胞溶解产物；(b)脱氧胆酸钠处理在步骤(a)第一澄清细胞溶解产物中加入脱氧胆酸钠，并将pH降低至4‑5，离心处理取上清液，得到酸化溶解产物；重复1‑2次,获得进一步纯化的酸化溶解产物；对进一步纯化的酸化溶解产物进行超滤浓缩，以获得第二澄清细胞溶解产物；(c)核酸酶处理使用核酸酶处理所述步骤(b)中的第二澄清细胞溶解产物；在核酸酶处理的细胞溶解产物中加入脱氧胆酸钠，并将pH降低至4‑5，离心处理取上清液；对上清液进行超滤浓缩，获得纯化多糖溶液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：任克明，王玺，王剑虹，白贵杰，沈荣，
申请(专利权)人：兰州生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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