一种获取单克隆细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种获取单克隆细胞的方法，其具体步骤如下：(1)胰酶分离消化细胞，用完全培养基终止消化，制成单细胞悬液；(2)吸取适量单细胞悬液至微孔板的一个孔中，放置在显微镜下数出该悬液中的细胞总数，并且通过增减细胞悬液体积，使得该孔内细胞总数达到所需克隆的数量；(3)吸取适量培养基悬浮该孔内的细胞，再将其转移至含有培养基的具有易于均匀分散单细胞的结构的储液槽内，该培养基的体积为步骤(4)中准备加入微孔板各孔内培养基体积的总和；(4)吸取适量细胞悬液至微孔板各孔中，进行培养；(5)培养一至两周。该方法操作方法简单，并能最大限度地获得较多孔的单克隆细胞，建立单克隆细胞系成功率较高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞克隆
，涉及细胞培养、传代和单克隆细胞获得细胞系的方法。
技术介绍
细胞培养是细胞生物工程技术中最为重要的技术之一，它对人类的健康、抗体的研发和细胞免疫疗法产生深远影响。原代细胞可以通过组织块培养法和酶消化法获得。组织块培养法是通过将组织剪碎，然后再将其接种于培养瓶生长。酶消化法也是首先将组织剪碎，然后再通过高浓度酶消化的方法获得细胞。在此过程中，细胞会经历高浓度、长时间的酶消化，从而导致细胞膜受体受损，影响正常细胞分子信号转导和生物学功能。这两种方法虽然都能够在体外获得原代细胞，但是经其所获得的原代细胞在经过几次传代之后，会开始衰老和凋亡。根据研究(Karantza-Wadsworth V.and White Ε.，2008:“Α MouseMammary Epithelial Cell Model to Identify Molecular Mechanisms RegulatingBreast Cancer Progress1n.Methods Enzymol.446:61-76)，在将致癌基因整合到原代细胞的基因组上后，致癌蛋白会使得原代细胞中一些与衰老相关的信号通路失活，从而其永生化，具有无限增殖的能力。然而，致癌基因一般是通过随机插入的方式导入到原代细胞基因组上的，可能导致细胞的生物学稳定性受到破坏。如果致癌基因被插入含有转录活性区的染色体上，就会导致细胞代谢功能的障碍。随着细胞传代数的增加，必然引起染色体功能的紊乱，从而很难保证所有细胞都具有同样的细胞生物学功能。这使得细胞间的生物学功能差异增大，并最终导致试验的数据结果产生误差。为了克服这一障碍，可以通过单克隆方法来进行对细胞的均一化处理。目前国内外基本上通过有限稀释法和克隆环法获取单克隆细胞。有限稀释法是通过对悬浮细胞进行计数，然后再将细胞进行一系列的稀释至5个/ml，再加入200 μ I的细胞悬液至96孔板中，从而在理论上实现96孔板的每孔只有一个细胞的目的。然而，在实际操作中达到的每孔细胞数目却并不准确。因为，细胞在计数的过程中误差能够达到14个细胞，而且使96孔板每个孔就只有一个细胞，那么细胞总数需要96个。从这方面分析，这样的采用有限稀释法获取单克隆细胞的试验结果是不准确的。同时，在利用胰酶分离消化细胞时，尽管通过移液管吹打细胞以使其分离，但是，有些细胞依然是细胞团，无法成为单个细胞。在国外，人们也采用克隆环方法获取克隆细胞。这是一种获取单克隆细胞的简单易行的方法，可以有效地从培养皿获得所需要的单克隆细胞。但是，该方法所筛选的细胞并一定是单克隆细胞，可能是两个或三个细胞组成的细胞集落。同时，克隆环单克隆细胞在操作上较复杂且很难获得试验的成功。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种可获取单克隆细胞的方法，操作方法简单，并能最大限度地获得较多孔的单克隆细胞，为细胞克隆技术和稳定的细胞生物学功能奠定基础。本专利技术提供了，其具体步骤如下:(I)胰酶分离消化细胞，用完全培养基终止消化，吹打悬浮细胞，使细胞成为单细胞悬液；在此步骤中，为了达到更好的细胞团分离效果，可以使用m)TA对步骤⑴中得到的单细胞悬液进行分离消化，并再次进行胰酶消化，以获得较多的单细胞。(2)吸取适量的步骤⑴中所得的单细胞悬液至微孔板中一个孔中，将其放置在显微镜(如:倒置显微镜)下数出该悬液中的细胞总数，并且通过增减细胞悬液体积，使得该孔内细胞总数达到所需克隆的数量。此操作中，也可以使用细胞计数板替换微孔板。(3)吸取适量的培养基悬浮该孔内的细胞，再将其转移至含有培养基的具有易于均匀分散单细胞的结构的储液槽内，以使得单细胞在储液槽内均匀分散分布，例如:可以使用“V”型储液槽或者其他易于均匀分散单细胞的结构，以达到更好的细胞均匀分散效果。该储液槽内培养基的总体积为所需克隆的单细胞数量与步骤(4)中准备加入到微孔板各孔内培养基体积的乘积。(4)吸取适量细胞悬液至微孔板各孔中，进行培养；吸取悬液时，可以采用排枪，以提尚效率。(5)培养一段时间(通常为一至两周)，观察孔内细胞生长情况。可选地，可以重复步骤(2)至(4)数次，以获得更多孔数的单克隆细胞。本专利技术的有益效果在于以下几点:(I)与传统的有限稀释法相比，本专利技术提供的获取单克隆细胞的方法能够获得更多且源自一个细胞的单克隆细胞系，建立单克隆细胞系的成功率较高。传统的单克隆细胞方法是经过一系列的有限稀释法，这种细胞密度上的不准确无法保证在微孔板上(通常96孔板)的每孔只有一个细胞，并且容易出现有些孔中没有细胞的情况，从而造成每孔接种细胞数目差异偏大。本专利技术建立的单克隆细胞方法，通过获得所需细胞总数，并且在操作时可控地使得单克隆细胞在储液槽中均匀分散分布(如:通过使用“V”型储液槽)，能够最大限度减少每孔细胞的误差，使每孔接种的细胞大多数都是I个细胞。(2)本专利技术建立的获取单克隆细胞的方法不需要经过一系列的连续稀释和计数，操作简单可行。在传统的单克隆细胞方法中，为了确保能够在96孔板上尽可能多的孔中获得单克隆细胞，需要使用大量的培养基进行一系列的连续稀释和计数，操作较为繁琐。相比之下，本专利技术建立的单克隆细胞方法不需要一系列的稀释，在节省了大量的培养基用量的同时，比传统的克隆技术节约了 I小时的试验时间。(3)通过本专利技术所获取的单克隆细胞在形态上保持一致，为能够进一步发挥细胞的生物学功能和遗传的稳定性奠定了基础。【附图说明】图1为通过本专利技术的方法单克隆奶牛乳腺上皮细胞的细胞形态学鉴定中的倒置显微镜观察图(X 100)(左图)以及其局部放大图(右图)。图2为通过本专利技术的方法单克隆猪小肠上皮细胞的细胞形态学鉴定中的倒置显微镜观察图(X 100)(左图)以及其局部放大图(右图)。图3为获取的单克隆奶牛乳腺上皮细胞进行单克隆细胞核型分析的高倍油镜观察图(XlOO)0【具体实施方式】为了阐明本专利技术的技术方案及技术目的，下面结合【具体实施方式】及附图对本专利技术做进一步的介绍。实施例1:使用本专利技术的方法单克隆了奶牛乳腺上皮细胞，具体方法如下:(I)使用胰酶对对数生长期的细胞进行消化分离，用含10%的血清培养基终止消化当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获取单克隆细胞的方法，其具体步骤如下：(1)胰酶分离消化细胞，用完全培养基终止消化，制成单细胞悬液；(2)吸取适量的步骤(1)中所得的单细胞悬液至微孔板中一个孔中，将其放置在显微镜下数出该悬液中的细胞总数，并且通过增减细胞悬液体积，使得该孔内细胞总数达到所需克隆的数量；(3)吸取适量的培养基悬浮该孔内的细胞，再将其转移至含有培养基的具有易于均匀分散单细胞的结构的储液槽内，该槽内培养基的总体积为所需克隆的单细胞数量与步骤(4)中准备加入到微孔板各孔内的培养基体积的乘积；(4)吸取适量细胞悬液至微孔板各孔中，放置培养箱中培养；(5)培养最长两周，观察孔内细胞生长情况。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵国琦，詹康，林淼，贡笑笑，左晓昕，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32