一种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法技术

本发明专利技术公开了一种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，将基因组DNA经亚硫酸氢盐转化后的PCR产物进行两核苷酸合成焦测序，连续记录每个测序反应得到包括两核苷酸种类及其核苷酸合成数目的测序编码信息。通过设定已确定的目标区域序列中所有CG位点中碱基C均不同程度的转化成T，再利用两核苷酸合成焦测序得到的信息，进行关联分析，实现目标区域序列中甲基化的定量分析。本发明专利技术能够大幅度提高测序长度，拓宽了传统焦测序的分析范围，适合单样本PCR产物、以及混合样本PCR产物序列的甲基化分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，是一种PCR产物序列分析方法，具体涉及一种两核苷 酸合成焦测序定量检测甲基化的方法。
技术介绍
人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因 时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅 猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相 互作用将成为可能。就基因序列分析而言，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移 到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。在基础研究方面，DNA的序列分 析是进一步研究和改造目的基因的基础，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用 方面，直接寻找疾病的易感基因突变位点，通过对某一特定疾病的基因组样本中突变基因 型进行大规模鉴定和检测，可以获得与该疾病相关基因型的信息。很多常见疾病的遗传学 影响可归因于有限的等位基因变异。越来越多的证据表明，DNA甲基化参与了胚胎发育、基 因印迹等过程。同时，它在疾病发展中也起着举足轻重的作用。甲基化状态的改变被认为 是引起癌症的一个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化水平的降低和CpG岛局部甲 基化水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定（如染色体的不稳定、原癌基因的表达）和 抑癌基因的不表达。 DNA甲基化分析包括定性与定量分析，目前有很多方法可以选择。基因组DNA经过 亚硫酸氢盐处理后，原始序列中未被甲基化的胞嘧啶（C)残基转化为尿嘧啶（U)，并在PCR 扩增中以胸腺嘧啶（T)出现；而被甲基化的胞嘧啶则保持不变。从亚硫酸氢盐转化这条主 干道出发，之后可以选择限制性酶切分析、实时定量PCR、Sanger测序、焦磷酸测序、以及高 通量DNA测序等。然而，并非所有方法都能提供单个CpG位点的定量数据。样本经亚硫酸氢 盐处理后PCR产物的Sanger测序一度被认为是甲基化分析中的金标准，但如果对5-10个 克隆测序，这种方法充其量只是半定量。高通量DNA测序对于甲基化研究，带来了非常灵敏 的DNA甲基化图谱，以单分子分辨率覆盖整个CpG岛。高通量DNA技术实现了整个CpG岛 的更全面覆盖，且单分子分辨率为甲基化模式的异质性提供了前所未有的信息。它能够平 行研究多个位点。然而，这些优点也伴随着一些劣势，比如相当大的一笔投资、试剂昂贵、周 转时间长、数据分析要求高等。这些特点使得高通量DNA测序技术更适用于在基因组范围 内目标区域的确定，而对不同样品在目标区域的CpG位点的定量分析由于样品数量大，如 果每个样品都采用高通量DNA测序技术进行分析，则成本就会过于巨大。 传统的焦磷酸测序技术能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进 行定性及定量检测。样本经过亚硫酸氢盐处理后的PCR产物在焦测序延伸过程中，根据C 和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确 检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。德国汉 诺威医学院Potapova领导的研究小组对高通量DNA测序和焦测序进行了系统的交叉验证 (BMC Biotechnology，2011，11:6)，对10个原发性肝癌标本中12个位点的甲基化模式在高 通量DNA测序所获得的单个CpG位点的甲基化水平与传统焦测序相应值进行比较的统计分 析表明，所有单个CpG位点的甲基化水平都有着极佳的一致性。表明传统的焦测序技术是 一种可用于目标区域的CpG位点定量分析的简单、价格便宜的分析技术。 然而，传统焦测序技术由于每个反应需要加入相应体积的dNTP，这样，随着测序反 应的进行，反应物的体积越来越大，其反应物的浓度也就越来越少，测序的准确性也就越来 越低。传统焦测序一般在优化核苷酸加入顺序的前提下也只能测定大约60bp的片段长度 (Mashayekhi F，Ronaghi M.A. Analytical biochemistry, 2007, 363, 275-28719)，而这种每 个甲基化位点需要两个测序反应的实现的传统焦测序技术对甲基化PCR产物的分析就更 加受到测序长度的限制。一种变通的方法是将这段长序列用多个测序引物分段进行焦测 序。然而，一方面，使用多个测序引物也会增加分析成本；另一方面，由于经过亚硫酸氢盐 处理后被甲基化的胞嘧啶则保持不变，因此每个位点被甲基化的程度不同，PCR产物中两种 DNA模板的含量也就不同，造成DNA模板类型的复杂，一般很难设计多个测序引物将其序列 分段进行测定。因而传统焦测序在对长片段序列甲基化的定量检测中存在不足。最近，我 们实验室提出一种基于两核苷酸实时合成测序的方法，该方法通过每次反应同时加入两种 dNTPs合成测序，得到两组编码，然后解码这两组编码便能确定测序片段的具体碱基信息 (肖鹏峰等，中国专利技术专利：ZL 2012 1 0128597.6)。该方法具有大幅提高测序长度，且测 序得到的测序信号强度比传单核苷酸合成测序的信号强等特点。然而，该专利技术专利只针对 一个DNA模板样本进行分析，无法对包含多个甲基化的DNA模板序列进行分析，限制了序列 分析的范围。由于经过亚硫酸氢盐处理后的PCR产物需要区分C、T碱基，而（dATPa S+dGTP) 合成焦测序没有办法区分这两种碱基，因此，两核苷酸的测序不包括这组组合形式。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种两核苷酸合成焦测序定量检测 甲基化的方法，为样本经过亚硫酸氢盐处理后的PCR产物提供一种快速、高效、灵敏的甲基 化定量分析方法。 为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案： -种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：其步骤包括：1) DNA提取；2)亚硫酸氢盐处理；3) PCR扩增；4)测序；5)关联分析； 所述步骤4)的测序方法为：每个测序反应同时加入两种不同的核苷酸，得到由连 续单个测序信息构成的一组测序编码信息。 所述步骤4)的具体方法包括以下步骤： 4-1)制备单链DNA模板：将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠反应，生物素 修饰的DNA链固定到所述磁珠上，在0. 05-0. 2M NaOH溶液下变性；将未固定的另一条DNA 链清除；然后用洗液洗涤，得到固定的单链DNA模板； 4-2)测序引物杂交：将测序引物与所述单链DNA模板在杂交反应体系中，70-80°C 下放置5-10min，自然冷却至室温，完成杂交； 4-3)测序：配备测序反应体系，与所述步骤3-2)得到的杂交产物混合，单个测序 反应选择两核苷酸组合为（dATP a S+dCTP)、（dATP a S+dTTP)、（dGTP+dITP)、（dCTP+dGTP)、 (dCTP+dTTP)之一进行；连续测序反应选择不同的两组两核苷酸组合循环进行，或者根据 分析的目标序列优化两核苷酸加入的顺序进行。 所述步骤4-2)中，所述测序引物是一段与单链DNA模板完全互补的一段序列。 所述步骤4)中，每个测序反应获得的测序信息包括两核苷酸种类信息和测序信 号强度信息，所述测序信号强度与合成核苷酸数目成正比，即每个测序反应的测序信号强 度均能够转化为核苷酸合成的数目。 所述步骤5)中，根据两核苷酸合成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：其步骤包括：1)DNA提取；2)亚硫酸氢盐处理；3)PCR扩增；4)测序；5)关联分析；所述步骤4)的测序方法为：每个测序反应同时加入两种不同的核苷酸，得到由连续单个测序信息构成的一组测序编码信息。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖鹏峰，刘文斌，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32