本发明专利技术涉及一种检测玉米褪绿斑驳病毒用引物及其检测方法，其引物是由上游引物和下游引物组成，上游引物及其寡核苷酸序列为MCMV-F：5' TGGAGCGAGTATTTTATGTG 3'、下游引物及其寡核苷酸序列为MCMV-R：5' GGTACAGGATCAGCTTTCTT 3'。由该引物组成的RT-PCR检测方法，包括总RNA提取、RT-PCR扩增和RT-PCR产物电泳检测过程。该方法具有良好的特异性、灵敏性高,适合玉米褪绿斑驳病毒的快速准确的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种。
技术介绍
玉米褪绿斑驳病毒{Maize chlorotic mottle virus , ΜΟΜ?)是我国颁布的禁止进境的检疫性有害生物。是一种直径30mm二十面体，正单链RNA植物病毒，它属于番前丛矮病毒科(Tombusviridae)玉米褪绿斑驳病毒属((Machlomoviru)，可通过昆虫介体和种子传播。该病毒的自然寄主有玉米、小麦、黍、大麦等。寄主被侵染后，症状表现为褪绿斑驳、坏死、矮化、穗发育差或无穗、过早死亡等症状。玉米褪绿斑驳病毒可引起10% -15%的产量损失，实验的玉米损失达59%，同时可与小麦线条花叶病毒(紛eai streak mosaic virus,WSMV),甘鹿花叶病毒(azosaic κ/τ?Λ?，SvMV)或玉米矮花叶病毒(ifeize dwarfmosaic κ/τ?Λ?，MDMV)复合侵染，形成玉米致死性坏死病(maize lethal necrosis, MLN),可造成平均高达75%的产量损失，给玉米带来毁灭性灾害。该病毒主要分布于阿根廷、墨西哥、秘鲁、美国(堪萨斯州、内布拉斯加州、夏威夷)等地。目前，我国仅云南省有该病毒发生的报道。随着玉米产业的迅速发展，种植者及加工企业对优良品种的需求越来越大，跨国种子企业试图进入玉米等种业市场的要求越来越强烈。我国近年来玉米种子的国际贸易越来越频繁，使其传入的风险也越来越大，该病毒一旦发生，将导致我国的玉米经济损失高达140亿元人民币。国内学者对该病毒的研究较少，因此相关资料及其防治经验很少。近年来发展的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法因其具有灵敏、快速、特异性强等优点，在植物病毒的检测上显示出强大的优势。自1990年起，国内外己相继用RT-PCR方法检测了多种病毒，如:马铃薯Y病毒(PVY)，马铃薯卷叶病毒(PLRV)，马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)等。目前对玉米褪绿斑驳病毒基本都是基于其外壳蛋白(CP)基因的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种检测玉米褪绿斑驳病毒用引物。本专利技术的目的之二在于提供该玉米褪绿斑驳病毒的检测方法。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案: 一种检测玉米褪绿斑驳病毒用引物，其特征在于该引物为:SEQ ID N0:2和SEQ IDNO:3所示的碱基序列。一种检测玉米褪绿斑驳病毒的方法，采用上述的引物进行PCR扩增，其特征在于该方法的具体步骤为:提取玉米褪绿斑驳病毒以及阴性病毒的总RNA，反转录为cDNA，最后进行PCR扩增，检测凝胶电泳检测扩增产物在301bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，则说明样品中含有玉米褪绿斑驳病毒；如果不存在，则说明样品中不含有玉米褪绿斑驳病毒。上述的反转录法为:RNA模板2 μ L，RNase-Free H2O 6 μ L混合，反应温度:65°C4min，冰上放置2min ;将5Xg DNA Buffer 2 μ L加入混合液中，反应温度42°C 3min ;向上述 10 μ L 体系中加入 1XFast RT Buffer 2 μ L，Enzyme Mix I μ L，10 μ M 反向引物 MR0.5 μ L^PRNase-Free H2O 至 20 μ L，反应温度 42°C 22min, 95°C 3min，_20°C保存备用； 上述的PCR扩增的体系为:50 μ L的PCR反应体系:10XPCR反应缓冲液5 μ L，dNTP为5 μ L，10 μ M上游引物和下游引物分别为I μ L，模板溶液为I μ L，TAQ酶为I μ L，最后补充ddH20 至 50 μ L ; 上述的PCR法的PCR检测体系的具体参数为:94° C预变性2min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为:94° C变性30s，55° C退火30s，72° C延生Imin ;循环30次后，最后72° C延生lOmin，降温至4° C，PCR扩增结束。登录号为EU358605.1的Plll基因第1600-2000位核苷酸序列为SEQID NO:1所示的碱基序列，序列中下划线部分的字母代表了引物MCMV-F和MCMV-R的位置 上游引物MCMV-F序列如SEQ ID NO: 2所示，序列特征: 长度:20bp 类型:核酸链型:单链拓扑类型:线形分子类型:DNA 最初来源:人工合成 下游引物MCMV-R序列如SEQ ID NO: 3所示，序列特征为: 长度:20bp 类型:核酸链型:单链拓扑类型:线形分子类型:DNA 最初来源:人工合成 本专利技术的优点和有益效果:对本专利技术的引物的特异性和灵敏度进行分析的结果，8株玉米褪绿斑驳病毒的阳性样品在301bp处均扩增出特异性条带，而阴性病毒在301bp处都未扩增出特异性条带。证明该引物具有良好的特异性。通过对引物灵敏度分析，该特异引物的灵敏度高，因此在样品量较少或者病毒含量在样品组织中含量很低的情况下，也能用该引物检测。本专利技术通过合成一对扩增玉米褪绿斑驳病毒Plll基因其中一部分序列的寡核苷酸引物，利用RT-PCR技术建立一种经济简便检测玉米褪绿斑驳病毒的方法。基于对病毒的Plll基因第1600-2000位核苷酸序列分析设计的特异性反转录引物的检测方法，在植物病毒检测上具有快速、灵敏、特异性强的特点。【附图说明】图1为实施例1中RT-PCR检测方法特异性评价凝胶电泳图；图2为实施例2中RT-PCR检测方法灵敏度评价凝胶电泳图。【具体实施方式】结合具体的实施例，进一步进行阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。所述试剂盒生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。实施例1: 一种玉米褪绿斑驳病毒RT-PCR检测方法，包括以下步骤: 步骤1，引物设计和合成 利用PR頂ER PRIMER5.0软件根据玉米褪绿斑驳病毒的Plll基因第1600-2000位核苷酸序列设计I对寡核苷酸引物，上游弓I物MCMV-F和下游引物MCMV-R上游引物及其序列为:MCMV-F (SEQ ID NO:2):5’-TGGAGCGAGTATTTTATGTG-3’ 下游引物及其序列为:MCMV-R (SEQ ID NO:3):5’-GGTACAGGATCAGCTTTCTT-3’ 步骤当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测玉米褪绿斑驳病毒用引物，其特征在于该引物为：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的碱基序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘战民，夏雪影，杨翠云，
申请(专利权)人：上海大学，上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：上海;31
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