利用对虾病毒IHHNV病毒样颗粒包裹特异双链RNA的方法，涉及对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒。提供一种具有特殊结构的dsRNA表达质粒、一种构建dsRNA表达质粒的克隆方法、一种含有dsRNA表达质粒与蛋白表达质粒的重组的原核细胞、一种dsRNA表达质粒与蛋白表达质粒的共表达方法、一种含有dsRNA表达质粒与蛋白表达质粒的重组的原核细胞表达包裹有目标dsRNA的VLPs的方法。构建dsRNA表达质粒可表达产生双链特异RNA，且可使其特异性地包裹入病毒样颗粒中，以产生具有RNA干扰作用的粒子。病毒样颗粒以其与天然病毒的相似性及不具有感染性等特点，在抗病毒药物的载体系统开发上具有很大前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒，尤其是涉及利用对虾病毒 IHHNV病毒样颗粒包裹特异双链RNA的方法。
技术介绍
对奸传染性皮下及造血组织坏死病毒（infectioushypodermaland hematopoieticnecrosisvirus，IHHNV)是世界各地养殖和野生对奸的重要病原 之一，是已知最小的对奸病毒，隶属于细小病毒科（Parvoviridae)短浓核症病毒属 (Brevidensovirus)。该病毒分布广泛，对细脚滨对奸有较高致病性和死亡率（90% )， 对已被广泛养殖的凡纳滨对奸可导致慢性矮小残缺综合症（runt-deformitysyndrome， RDS)，使生长畸形，造成较大经济损失。IHHNV的病毒粒子直径约22nm，是无囊膜包被 的二十面体，其基因组是线性单链DNA，长度为4.lkb，由三个开放阅读框和两末端的非 编码序列构成，预计三个0RF分别编码非结构蛋白l(nonstructuralprotein1，NS1), 非结构蛋白 2(nonstructuralprotein2,NS2)和衣壳蛋白（capsidprotein,CP) (1、 BonamiJR,TrumperB,MariJ,BrehelinM,andLightnerDV. (1990).Purificationand characterizationoftheinfectioushypodermalandhaematopoieticnecrosis virusofpenaeidshrimps.JGenVirol71(Pt11) : 2657-2664 ;2、ShikeH,Dhar AK,BurnsJC,ShimizuC,JoussetFX,KlimpelKR,andBergoinM. (2000).Infectious hypodermalandhematopoieticnecrosisvirusofshrimpisrelatedtomosquito brevidensoviruses.Virology277(1) : 167-177)。2008 年，本申请人对对奸传染性皮下及 造血组织坏死病毒（中国福建株）全基因组进行了测定（GenBankAcc.EF633688) (3、吴昊， 徐丽美，杨丰.（2000).对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（福建株）基因组的克隆.台 湾海峡27:147-151)，此前虽然在中国大陆大部分地区均发现养殖对虾感染IHHNV(4、Yang B,SongXL,HuangJ,ShiCY,andLiuL. (2007).Evidenceofexistenceofinfectious hypodermalandhematopoieticnecrosisvirusinpenaeidshrimpculturedin China.VetMicrobiol120 (1-2) : 63-70)，但并未见其基因组序列报道。序列测定显示该病 毒基因组全长3833bp，DNAMAN5. 0软件分析发现有三个较大的0RF位于正链DNA中，其中 0RF3起始于2521nt，结束于3510nt，编码的蛋白约有329个氨基酸，分子量为37kDa，预测 其产物为衣壳蛋白。 近年来，许多种病毒的衣壳蛋白基因都能在原核表达系统、酵母表达系统、 植物表达系统以及昆虫表达系统中表达，并且自组装成病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs)。绝大多数VLPs的构建选择的都是真核细胞表达系统，使用原核表达 系统的较少，主要是由于原核表达系统不能对蛋白进行必要的修饰，不利于VLPs的形成。 但是原核系统以其操作方便、表达高效、易于纯化等优点受到广泛应用。研究表明，原核 细胞中表达人乳头瘤病毒HPV16(Humanpapillomavirus16，HPV16)的L1蛋白可高效地 组装成VLPs。HPV16型L1蛋白在鼠伤寒沙门氏菌中表达，可获得VLPs，结构与天然HPV 类似，首次证实HPVL1蛋白能够在原核细胞中自行组装成VLPs(5、Nardelli-Haefliger D，RodenRB，BenyacoubJ,SahliR，KraehenbuhlJP，SchillerJT，LachatP，PottsA，and DeGrandiP. (1997).Humanpapillomavirustype16virus-likeparticlesexpressed inattenuatedSalmonellatyphimuriumelicitmucosalandsystemicneutralizing antibodiesinmice.InfectAndImmun65(8) :3328_3336)dChuanYP等对宿主株系、表 达质粒、诱导剂浓度、培养条件进行了筛选与优化，通过低密度大肠杆菌高水平表达形成 VLPs的可溶性结构蛋白，使表达水平达到了 180mg/L(6、ChuanYP，LuaLH，andMiddelberg AP. (2008).High-levelexpressionofsolubleviralstructuralproteinin Escherichiacoli.JBiotechnoll34(l-2):64-71)c3目前，通过利用昆虫杆状病毒表达载 体，许多细小病毒的衣壳蛋白都可以在昆虫细胞中表达并自组装成病毒样颗粒。腺联病毒 (adeno-associatedvirus，AAV)、B19病毒（humanparvovirusB19)、猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV)、鼠细小病毒（parvovirusminutevirusofmice，PMVM)和犬细小病毒 (canineparvovirus，CPV)的衣壳蛋白都已经在昆虫细胞中被成功表达且自组装成VLPs。 但是还没有关于细小病毒衣壳蛋白能在原核表达系统中表达并自组装成VLPs的报道。 与天然病毒粒子相比，病毒样颗粒保持了天然病毒所具有的均一性，细胞取向性， 与病毒受体定向结合性，并且在细胞内部的运输机制也与天然病毒相似。此外，由于病毒样 颗粒不携带病毒自身的遗传物质，不能自行复制，所以不存在感染性。但正是由于此，病毒 样颗粒可用于某些治疗目的的载体系统，运输核酸、蛋白、小分子物质或某些药物。在治疗 性疫苗的研究中，选择高效、安全、特异的载体系统很关键。病毒衣壳蛋白一般具有碱性多 肽域，这些碱性多肽域朝向颗粒的内表面，由于核酸的磷酸基团骨架呈负电荷，二者之间能 形成一种高亲和性、非特异性的相互作用力。类似地，核酸以外的其它分子，只要带有合适 的电荷，都能被包裹入VLPs中或结合于其表面（7、PetryH，ColdmannC，Ast0，andLuke ff. (2003).Theuseofvirus-likeparticlesforgeneTransfer.CurrOpinMolTher 5(5) :524-528)，因此，VLPs可作为基因或药物转移的载体。并且由于VLPs的空间阻隔作 用，内部的核酸分子能有效地受到保护，不会遭到核酶的破坏。 鉴于VLPs与天然病毒本文档来自技高网...
【技术保护点】
具有特殊结构的dsRNA表达质粒，其特征在于是具有下述结构特征的DNA分子：1)具有两对T7启动子和终止子；2)具有一段与衣壳蛋白结合的特异性序列；3)具有一段特异性的目标基因，以用于产生对应的dsRNA，位于T7启动子和终止子之间。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：侯路红，林梵宇，杨丰，徐丽美，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35
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