用于检测ALDH2基因的引物、探针及其检测方法，利用杂合子型ALDH2*1/*2、纯合子型ALDH2*2/*2和内参基因β-珠蛋白的引物探针配制PCR反应液，加入人全血样本DNA，通过荧光PCR仪检测ALDH2基因的多态性。本方法检测特异性探针对靶基因进行识别，准确性高。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低；灵敏度为0.01％，即10000个细胞中有一个含ALDH2基因ALDH2*1/*2多态性、ALDH2基ALDH2*2/*2多态性就可以被检测出；扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易被污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理；全程监控：本发明专利技术实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性；快速：速度快、可在100分钟内完成。
【技术实现步骤摘要】
： 本专利技术涉及检测人血液样本中ALDH2基因多态性的引物、探针及其检测方法，属 于分子生物学领域。
技术介绍
： 乙酸脱氢酶（aldehyde dehydrogenase gene, ALDH)是一组 NAD (P) + 依赖性酶，广 泛参与由体内乙醇、氨基酸、生物胺、维生素、类胆固醇及脂质的代谢过程中产生的醛类物 质的氧化反应，成为相应的羧酸，对减轻醛类物质对机体的毒性作用具有重要意义。ALDH有 19种同工酶，常见的有ALDH1~ALDH4,其中以位于线粒体内的ALDH2活性最强，在清除体 内醛类物质中起主要作用。ALDH2的活性变化与ALDH2基因多态性有关，突变的等位基因形 成人群中三种基因型：具有正常催化活性的野生纯合子型ALDH2*1/*1 ;催化活性下降的杂 合子型ALDH2*l/*2 ;催化活性丧失的突变纯合子型ALDH2*2/*2。在亚洲人群中，ALDH2*2 是频率最高且最重要的突变型，其中研究显示中国人ALDH2*2的频率达18%。 研究表明，ALDH2基因多态性与硝酸甘油疗效、酒精代谢解毒能力和多种疾病的发 生均有影响。 ALDH2基因多态性与硝酸甘油的用药有关：舌下含服硝酸甘油片是抗冠心病心绞 痛急性发作的常规首选方法，但有些患者服用后并无疗效。ALDH2酶是硝酸甘油有效代谢 物N0形成的关键，当ALDH2基因在rs671位点突变后，酶活性降低，硝酸甘油在体内生物转 化过程受阻，有效活性产物N0生成减少，进而导致硝酸甘油治疗心绞痛效果降低。因此， ALDH2基因多态性检测有助于临床上指导硝酸甘油的合理利用，对实现个体化治疗具有重 要意义。 ALDH2基因多态性与酒精性肝病的关系：ALDH2 (Glu504Lys)基因突变使乙醛脱氢 酶活性也降低10倍以上，使酒精在体内从乙醇一乙醛一乙酸一水、二氧化碳的代谢过程受 阻，大量乙醛滞留在体内。加之高频饮酒易引发酒精依赖现象，进一步加重了肝脏的受累程 度。长期大量饮酒会导致脂肪肝甚至酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化，严重危害人民健康。 对ALDH2基因多态性的检测将有助于揭示个体酒精代谢能力，指导检测者正确饮酒，预防 酒精性肝病。 ALDH2基因多态性与食道癌和口腔癌等的关系：除了损伤肝脏导致脂肪肝、肝硬 化，甚至肝癌，还与增加食道癌、咽癌和胃癌、结肠癌、肺癌等风险相关。研究显示，携带 ALDH2突变等位基因的亚洲人因酗酒引发消化道癌症的几率明显较大：胃癌、结肠癌、肺癌 为3~10倍；咽癌、食道癌为11~115倍；而食道癌、咽癌和肺癌同时发病的几率增加了 50倍。ALDH2基因的检测将为食道癌、咽癌和胃癌、结肠癌、肺癌等相关尚风险疾病的提不 提供有效的参考依据。 目前市场上常用的ALDH2基因检测方法有基因芯片法和PCR-RFLP，基因芯片法是 目前市场上应用最多的一种方法，最大的优点是高通量，但也存在着不足之处：技术成本昂 贵、操作复杂、检测灵敏度较低及重复性差等。PCR-限制性片段长度多态性技（PCR-RFLP) 操作繁琐、耗时多、结果可信度低等缺点，未能普及。因此，本领域亟需一种快速、高效、准 确、便捷、灵敏度高且结果准确性好的ALDH2基因型检测试剂。
技术实现思路
： 为了克服现有技术检测能力有限，现提供一种多色荧光PCR检测ALDH2基因的方 法。 本专利技术是采用多色荧光PCR检测ALDH2基因的方法：利用杂合子型ALDH2*l/*2、 纯合子型ALDH2*2/*2和内参基因0 -珠蛋白的引物探针配制PCR反应液，加入人全血样本 DNA，通过荧光PCR仪检测ALDH2基因的多态性。 以上所述的引物探针序列如下： ALDH2-F : 5，-CCAACAGGCCCTGAGCC-3 ' ALDH2-R : 5 ' -CACCCTTTGGTGGCTACAAGATG-3 ' HBB-F1 :5' -TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT-3' HBB-F2 :5, -TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA-3' P-ff ：5, -FAM-ACAGTTTTCACTTCAGTGTATGCCTGCAG-BHQl-3 , P-M : 5 ' -HEX-AGTTTTCACTTIAGTGTATGCCTGCAG-BHQ1-3 ' HBB-P : 5 ' -R0X-ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC-BHQ2-3 ' 本专利技术的主要原理：本专利技术基于焚光PCR方法结合Taqman多色焚光探针技 术，采用三色荧光PCR和dUTP/UNG防污染措施在全封闭的扩增体系，以ALDH2*l/*2和 ALDH2*2/*2作为检测目标，同时针对人的珠蛋白基因（HBB)保守区域设计特异性引物 和探针作为内参对样本的采集、DNA的提取及扩增进行监控。将同一样本进行1管PCR扩 增即可同时检测出ALDH2基因的多态性，为硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险疾病 的提不提供有效的参考依据。 本方法与现有技术相比具有以下优势： (1)检测特异性探针对靶基因进行识别，准确性高。同时，靶序列由引物和探针双 重控制，特异性好、假阳性低。 (2)灵敏度为0.01%，8卩10000个细胞中有一个含八0)112基因八0)112*1/*2多态性、 ALDH2基因ALDH2*2/*2多态性就可以被检测出。 (3)简便安全：操作简单、安全、能防止污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不 需要开盖，不易被污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理。 (4)全程监控：本专利技术实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系， 对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。 (5)快速：速度快、可在100分钟内完成。【附图说明】： 图1显示ALDH2基因ALDH2*l/*2多态性在PCR反应液中的扩增曲线； 图2显示ALDH2基因ALDH2*2/*2多态性在PCR反应液中的扩增曲线； 图3显示ALDH2基因无ALDH2*l/*2多态性和ALDH2*2/*2多态性时，在PCR反应 液中的扩增曲线。【具体实施方式】： 附图1显示ALDH2基因ALDH2*l/*2多态性在PCR反应液中的扩增曲线，其中，横 坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值； 附图2显示ALDH2基因ALDH2*2/*2多态性在PCR反应液中的扩增曲线，其中，横 坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值； 附图3显示ALDH2基因无ALDH2*l/*2多态性和ALDH2*2/*2多态性时，在PCR反 应液中的扩增曲线，其中，横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值 下面结合具体实施例，对本专利技术进一步说明，但专利技术的保护范围并不限于此。 (1)引物探针的设计 根据GenBank所提供包含线粒体乙醛脱氢酶-2多态性位点上下游各lOOObp的 DNA序列进行分析，利用分子生物学软当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测ALDH2基因的引物、探针，其特征在于：其引物探针序列如下：ALDH2‑F：5’‑CCAACAGGCCCTGAGCC‑3’ALDH2‑R：5’‑CACCCTTTGGTGGCTACAAGATG‑3’HBB‑F1：5’‑TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT‑3’HBB‑F2：5’‑TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA‑3’P‑W：5’‑FAM‑ACAGTTTTCACTTCAGTGTATGCCTGCAG‑BHQ1‑3’P‑M：5’‑HEX‑AGTTTTCACTTTAGTGTATGCCTGCAG‑BHQ1‑3’HBB‑P：5’‑ROX‑ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC‑BHQ2‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋冬梅，何胜祥，刘军辉，
申请(专利权)人：安徽同科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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