单核苷酸检测方法技术

本发明专利技术提供一种用于确定多核苷酸分析物中核苷酸碱基的序列的方法。其特征在于以下步骤：(1)通过焦磷酸解从分析物产生单核苷酸碱基流；(2)通过将各单核苷酸碱基与用处于不可检测状态的可检测元件标记的捕获系统反应产生捕获的分子；(3)从各捕获的分子释放处于可检测状态的可检测元件；以及(4)检测这样释放的可检测元件并且由其确定核苷酸碱基的序列。所述方法可以有利地用于涉及使用微滴的测序仪中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单核苷酸检测方法本专利技术涉及一种用于表征多核苷酸如来源于天然存在的RNA或DNA的那些的方法，所述方法是通过捕获并检测通过逐步焦磷酸解而由所述多核苷酸产生的单核苷酸碱基的有序序列。遗传物质的下一代测序已经对总体生物学和医学产生巨大的影响，尤其是因为测序的单位成本随着越来越快的测序仪进入市场而直线下降。因此，在一种这样的机器中，首先将双链DNA分析物分解为多个更小的多核苷酸片段，各个多核苷酸片段首先在一条链的两端被腺苷酸化(adenylate)，使得单链第一寡核苷酸可以通过与未配对的腺嘌呤碱基杂交结合于其互补体(compliment)的两端。然后将这样获得的处理的片段按大小进行选择并捕获到用结合的单链第二寡核苷酸包被的表面上，所述单链第二寡核苷酸自身是第一个的序列互补体，使得实质上，通过进一步杂交可以形成表面结合的双链片段的文库。在随后的聚类(clustering)步骤中，随后使用延伸和等温桥接反应将这些文库组分在表面上克隆扩增数百万次，以利用未使用的第二寡核苷酸。这实质上产生了通过其一条链结合于表面的稠密浓度的多核苷酸片段。然后除去各个片段的未结合的互补链，从而留下结合的单链片段供测序使用。在测序阶段，用引物引发(prime)这些单链片段中的每个并且通过使用聚合酶链反应和双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)形式的DNA的四种特征核苷酸碱基的混合物进行延伸来再产生其互补链。各个ddNTP类型用在不同波长发荧光的不同荧光团标记的部分封端。然后延伸反应采用三步骤的循环形式；首先相关ddNTP被结合到生长的链中；接下来通过照射样品并检测荧光的波长来鉴定其包含的核苷酸碱基，并且最后除去封端及其相关荧光团从而允许接下来的延伸事件发生。通过这种方式，互补链的序列可以逐个碱基地建立。将理解的是，虽然这种方法可以是高度自动化的并且可以产生高准确度的序列读取，但其运行速度受延伸循环速率的限制。因此，在实践中，该技术的使用倾向于包括平行处理相对短的多核苷酸片段和自由其获得的各种读取结果(reads)组装整个序列。这本身可能导致计算的复杂度并且可能引入错误。最近已经进行尝试开发直接测序方法。例如，WO2009/030953公开了一种新型快速测序仪，其中尤其是，单链或双链多核苷酸样品(例如天然存在的RNA或DNA)中的核苷酸碱基或碱基对的序列通过将其经由设置有并置在纳米孔(nanopores)的出口内或附近的等离子体纳米结构(plasmonicnanostructures)的纳米穿孔基板转移来读取。在该装置中，所述等离子体纳米结构限定检测窗(实质上是电磁场)，在所述检测窗内，通过与入射光相互作用，各核苷酸碱基(优选标记的)又被诱导从而以特征方式发荧光或拉曼散射光子。随后远程检测这样产生的光子，多倍化(multiplexed)并转化为数据流，其信息内容表征为与多核苷酸相关的核苷酸碱基序列。然后可以使用被嵌入在被编写入与其集成的微处理器或与其连接的辅助计算装置中的相应软件中的计算算法将该序列由所述数据流复原。关于使用等离子体纳米结构和其相关共振特征的进一步背景可以在例如Adv.Mat.2004，16(19)pp.1685-1706中找到。另一种快速测序多核苷酸的装置在例如，US6627067，US6267872和US6746594中描述。在其最简单的形式中，该装置使用电极替代等离子体纳米结构，来限定跨过基板或在纳米孔出口中或纳米孔出口周围的检测窗。随后应用跨电极的电位差，并且测量作为多核苷酸和相关电解质经由纳米孔的电泳转移的结果的电极之间流动的离子介质的电学特性的改变，作为时间的函数。在该装置中，因为多种个体核苷酸碱基通过检测窗，它们连续阻塞和开启检测窗，引起导致电流或电阻率的特征性波动的‘事件’。然后这些波动用于产生合适的数据流用于上述分析。稳定小滴流(dropletstream)，特别是微滴流(microdropletstream)的产生，已经应用于分子生物学的技术的另一开发领域。例如，US7708949公开一种用于在油中产生稳定的水滴的新型微流体方法，同时例如US2011/0250597描述了使用该技术产生含有核酸模板(通常是多核苷酸DNA或RNA片段)和使得能够使用聚合酶链反应扩增所述模板的多个引物对的微滴。其他与该领域相关的专利申请通常包括JP2004/290977，JP2004/351417，US2012/0122714，US2011/0000560，US2010/01376163，US2010/0022414和US2008/0003142。WO2004/002627公开了一种使用各种装置产生液-液和气-液分散体的方法，所述方法包括在上游和下游微流体区域之间形成不连续部分。然而，未教导将其用于单核苷酸DNA测序。WO2010/077859教导了一种小滴执行器(actuator)，其包括设置有电极的基板、反应器通路和核苷酸碱基、洗涤缓冲液、样品和酶储库(reservoirs)。虽然总体上该执行器被说成是用于扩增和测序核酸，但是没有教导我们在下文描述的分析物降解方法。相反，其涉及完全不同的方式；使用焦磷酸测序观察分析物的互补链的合成。US2009/0280475涉及类似的主题。生物探针，通常包含已知序列顺序的长度小于1000个核苷酸的单链寡核苷酸，其被广泛用于分析分子生物学。这种探针通常通过在探针和靶标的核苷酸碱基之间存在足够的序列互补性时将其自身连接于靶标(例如源自天然存在的病原体的DNA的靶标)而起作用。通常，这种探针的核苷酸用可检测元件如放射性或荧光标志物标记，以使得当将探针用于处理据信其中或其上已经捕获有靶标的分析物溶液或基板时，通过寻找并检测检测元件的特征检测性质来表明所述靶标存在与否。此种探针中的一类的代表是本领域中被称为‘分子信标(beacon)’的物质，如例如US8211644中所述的。这些探针由以下构成：已经实际上被回折于其自身上以形成充当探针的感受器的残留的单链环的单链寡核苷酸，和短茎(stem)，其中临近两端的核苷酸通过互补核苷酸碱基配对彼此结合；从而形成双链区域。这种可以比作发夹的布置(其中单链环连接于理论上的双链寡核苷酸的同一端的互补链)是高度应变的。向所述寡核苷酸的3’和5’自由端(现在彼此临近并且在所述茎的远端处)分别连接荧光团和猝灭剂。随后其彼此的几何学接近保证无显著荧光产生。在使用中，靶标结合于单链环，产生额外的应变，以致当加热探针时，所述茎解链，从而导致荧光团和猝灭剂产生距离并使得前者发荧光。现在，我们已经开发了一种新型测序方法，在一个实施方案中，其包括通过逐步降解分析物产生核苷酸碱基流，其排序表征分析物中的序列；并且随后以使得其能够被检测的方式捕获各核苷酸碱基。WO94/18218公开了一种基因组测序仪，其中从分析物分离有序的单核苷酸流并且之后将其包含在荧光增强固体基质中，在那里，使用激光激发各核苷酸并且检测其特征光谱发射。该测序仪使用的单核苷酸转移法包括形成流动的不可混溶的液体的单个双鞘(dual-sheath)，而不是一系列小滴。此外，所述测序仪试图直接检测单个核苷酸，而不是使用我们描述的类型的捕获系统和荧光团释放方法。我们相信，这是一个缺点，因为它将导致检测发射时的信噪本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于确定多核苷酸分析物中核苷酸碱基的序列的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过焦磷酸解从所述分析物产生单核苷酸碱基流；(2)通过将各单核苷酸碱基与标记有处于不可检测状态的可检测元件的捕获系统反应来产生捕获的分子；(3)从各捕获的分子释放处于可检测状态的所述可检测元件；和(4)检测这样释放的可检测元件并且由其确定核苷酸碱基的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.04.09 GB 1306444.91.用于确定多核苷酸分析物中核苷酸碱基的序列的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过在存在焦磷酸解酶的情况下逐步焦磷酸解从所述分析物产生单核苷酸碱基三磷酸流；(2)通过在存在聚合酶和连接酶的情况下将各单核苷酸碱基三磷酸与捕获系统反应来产生捕获的分子，所述捕获系统(i)由两个组分构成，所述两个组分包括(a)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含双链区域和单链区域，和(b)第二单链寡核苷酸，所述第二单链寡核苷酸的核苷酸碱基序列与所述第一寡核苷酸的单链区域的核苷酸碱基序列至少部分互补；或(ii)由单个寡核苷酸构成，所述单个寡核苷酸包含单链核苷酸区域，所述单链核苷酸区域的末端与两个不同的双链寡核苷酸区域连接；并且其中所述捕获系统标记有处于不可检测状态的可检测元件；(3)使用核酸外切酶或聚合酶的核酸外切酶活性从各捕获的分子释放处于可检测状态的所述可检测元件；和(4)检测这样释放的可检测元件并且由其确定核苷酸碱基的序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸分析物结合于表面。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述焦磷酸解酶在步骤(1)的反应条件下不呈现核酸外切酶或核酸内切酶行为。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)在包含所述焦磷酸解酶、焦磷酸根阴离子和镁阳离子的流动水性介质的存在下在非平衡条件下进行，并且其中所述单核苷酸碱基三磷酸被连续地从产生它们的反应区处移走。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)和(2)之间，通过焦磷酸酶破坏任何残留的焦磷酸根阴离子。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在捕获系统(i)中，所述第一寡核苷酸是j形的。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在捕获系统(i)中，所述第一寡核苷酸的总长为20至100个核苷酸碱基。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在捕获系统(i)中，所述可检测元件与所述第二寡核苷酸连接并且是已被至少一种猝灭剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡梅伦·亚历山大·弗雷林，巴纳比·巴姆福思，布鲁诺·弗拉维奥·诺盖拉·德·索萨·苏亚雷斯，托马斯·亨利·艾萨克，鲍里斯·布赖纳，亚历山德拉·纳塔莱，米歇尔·阿马西奥，保罗·迪尔，
申请(专利权)人：贝斯四创新公司，医药研究委员会，
类型：发明
国别省市：英国;GB