一种重组酯酶、编码基因、载体、工程菌及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种来自反硝化无色杆菌zjut1104的重组酯酶、编码基因、载体、工程菌及在催化农药中间体(R，S)-2，6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的不对称水解中的应用；所述酯酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；本发明专利技术所述含重组酯酶基因的工程菌表达的酶活比原始菌株分别高了21.6倍和26.1倍，为超表达；本发明专利技术提供的重组酯酶EHesterase和BXesterase催化(R，S)-2，6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的不对称水解，当底物浓度为5％(m/v)时，37℃下反应3h，底物的转化率分别是43.1％和53.2％，产物2，6-二甲基苯基氨基丙酸的eep分别是76.0％和68.4％，对映体选择性是R型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及反硝化无色杆菌来源酯酶的编码基因 及应用。 (二）
技术介绍
N-取代苯基-a-氨基丙酸是一类重要的手性合成中间体，由该类中间体合成的 农药已经形成了一类重要的农药体系-酰胺类农药，其中甲霜灵、氯霜灵、呋霜灵、异霜灵 和苯霜灵为杀菌剂，异丙甲草胺、新燕灵和麦草伏为除草剂。 甲霜灵是酰胺类杀菌剂中最为普遍的成员，在世界防治卵菌亚纲病害（霜霉病和 晚疫病）市场上甲霜灵产品占15%。甲霜灵有R和S构型两种对映异构体。体外生物活性 测试表明R异构体大约比S异构体高1000倍。体内测试显示R体活性比S体高3倍。外 消旋甲霜灵目前在一些国家正在被主要由R体组成的精甲霜灵所代替，典型的精甲霜灵产 品由97. 5%的R体以及2. 5%的S体构成。光学纯产品替代外消旋（或异构体混合物）产 品不仅提高了使用药效而且还能减少释放到环境中的农药总量，减少非活性异构体在生物 圈内的扩展，从而减小对非靶标生物的潜在副作用。而且，光学纯产品的使用还有利于产品 的生产、运输和储存。 目前，大量的手性化合物的制备是通过化学拆分法完成的。利用生物酶法拆分 手性化合物比化学拆分法具有明显的优越性：（1)酶催化的反应通常具有高度的立体专一 性。因此得到的产物旋光纯度很高。（2)副反应少，产率高，产品分离提纯简单。（3)酶催 化的反应大多在很温和的条件下进行，温度区间0~50°C，pH值接近中性。因此没有设备 腐蚀问题，生产安全性也高。 酯酶（Esterase)是一类能够催化酯键形成和断开的水解酶，能够参与酯化反应、 转酯反应及对光活性物质进行动力学拆分等多种反应。酯酶种类多、来源广，所催化的反应 不需要辅酶。另外酯酶还具有水解作用底物广泛且能进行不对称酯化或水解，对很多反应 具有高度的立体选择性和专一性，因此酯酶被广泛应用于食品、新型生物材料、化工、生物 传感器、生物医学、生物柴油及手性药物等领域。目前酯酶已经成为在生物技术和有机合成 方面应用最广泛的酶之一。 黄丽琴，杨红等人（酶法拆分（±)-N-(2,6-二甲苯基）-丙氨酸甲酯.有机化 学，2005, 25 (12) =1575-1579.)用皱褶假丝酵母催化拆分（R，S)-2, 6-二甲基苯基氨基丙酸 甲酯，反应120h底物转化率达到了 31. 2%，产物对映体过量值为81. 34%。 农药中间体N_(2, 6-二甲苯基）氨基丙酸甲酯的结构式： Oh-JinPark等人（Enzyme-catalyzedpreparationofmethyl(R)-N-(2, 6-dime thylphenyl)alaninate:akeyintermediatefor(R)-metalaxyl,Tetrahedron:Asymme try2005, 16:1221 - 1225)用来自Burkholderiac印acia的LipasePS催化（R，S)-2,6_: 甲基苯基氨基丙酸甲酯的水解，酶和底物用量之比为1 :2 (g/g)，反应3h，转化率为17. 1 %， eep达到96. 6%，选择性为R型。王岩等人（精甲霜灵的合成研究（D)，吉林：吉林大学， 2008)利用假单胞菌脂肪酶PSL催化拆分（R，S)-2, 6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯，酶和底物 用量之比为1 :5. 5 (g/g)，反应时间在38h，转化率为50 %，产物的eep达到99%，选择性是 S型。而利用南极假丝酵母脂肪酶CAL-B，反应2h，转化率为48. 2 %，产物的eep为69. 2 %， 选择性是R型。 本专利技术提供一种能够水解农药中间体（R，S)_2, 6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的新 酯酶，与王岩等人所报道的南极假丝酵母脂肪酶CAL-B在选择性的性能方面比较相似，但 是由于用酶量差别很大，该新酯酶的活性要远高于脂肪酶CAL-B。本专利技术所述新酯酶的典型 用量是：折算后的湿菌体（所用酶从中提取）与底物的质量比为1 :2. 4(g/g)，众所周知，某 一种酶在湿菌体中的含量是很低的。而王岩等人所用酶CAL-B为酶粉。 (三）
技术实现思路
本专利技术提供一种能够催化农药中间体（R，S)_2, 6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯不对 称水解的新酯酶，该酯酶具有高的反应活性和相当高的对映体R型选择性。 本专利技术提供一种来源于反硝化无色杆菌（Achromobacterdenitrificans) zjutll04的重组酯酶，所述重组酯酶的氨基酸序列为SEQIDNO. 3(重组酯酶Hfesterase， 简称Hfest)或SEQIDNO. 4(重组酯酶BXesterase，简称BXest)所示。 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQN0 :3或SEQIDN0. 4所示氨基酸序列的 多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽 变体与前述氨基酸序列同源性在80%以上，均属于本专利技术保护范围之列。具体的，所述改变 可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的 氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有 非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。 本专利技术提供了编码上述重组酯酶的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQID NO. 1 (EHest)或SEQIDNO. 2 所示（BXest)。 由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQIDNO:1或SEQIDNO. 2所示多核苷酸的变 体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源性，均属于本专利技术保护范围之列。所述多核苷 酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使 生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所 知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插 入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。 本专利技术还提供由所述重组酯酶编码基因构建的重组载体（具体为 EHest-pET28a(+)和BXest-pET28a(+))，及由所述重组载体转化获得的重组基因工程菌 (具体为EHest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3)plysS和BXest-pET28a(+)-BL21Gold(DE3) plysS)〇 此外，本专利技术提供一种所述重组酯酶在催化（R，S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲 酯水解制备R-2, 6-二甲基苯基氨基丙酸中的应用，具体所述的应用以含重组酯酶基因的 工程菌经发酵培养获得的湿菌体用PH7. 0磷酸盐缓冲液悬浮并将悬浮液进行超声破碎、离 心后的上清液为催化剂，以（R，S)-2, 6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯为底物，以吐温80作为乳 化剂，以PH7. 0磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在20~60°C、120~240rpm条件 下进行水解反应，反应完全后，获得含R-2, 6-二甲基苯基氨基丙酸的混合液，将混合液分 尚纯化，获得R_2, 6-二甲基苯基氨基丙酸。 进一步，所述催化剂的用量以超声破碎前湿菌体的重量计为3_12g/L反应体系， 所述底物终浓度为50-250g/L反应体系，所述乳化剂的质量用量为20g/L反应体系。 进一步，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)zjut1104的重组酯酶，其特征在于所述酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张朝晖，卢亚南，陈小龙，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33