一种检测肝癌标志物IMP1抗原表位氨基酸序列及应用制造技术

一种检测肝癌标志物IMP1抗原表位的氨基酸序列及应用，属于免疫学技术领域，本发明专利技术提供了一种肝癌相关基因IMP1的抗原氨基酸序列。应用IMP1多肽抗原检测肝癌患者血中相应的特异性自身抗体，这种自身抗体可作为肝癌标志物评估肝癌发生的危险度及预后疗效。这种抗原多肽及其抗体可用于制备肝癌早期诊断、预后预测试剂和开发治疗肝癌的靶向药物。

【技术实现步骤摘要】
一种检测肝癌标志物IMP1抗原表位氨基酸序列及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种具有检测肝癌标志物IMP1多肽片段。
技术介绍
肝癌是目前我国发病率和致死率位居第二位的恶性肿瘤，每年约有30万例新发肝癌，占全球50%以上。肝癌发展迅速、易转移，是目前治疗最困难、预后最差的恶性肿瘤之一。然而，相对于乳腺癌、肺癌和前列腺癌等其他类型的恶性肿瘤，至今仍缺乏对肝癌发病相关肿瘤标志物分子认识。大量研究表明，血清或血浆中的肿瘤相关抗原能诱导机体产生自身抗体，在肿瘤患者血清中既存在肿瘤抗原，也存在针对该肿瘤抗原的自身抗体。因此，既可以利用抗体检测肿瘤抗原，也可以利用抗原检测肿瘤抗原的自身抗体，但利用肿瘤自身抗体检测肿瘤的特异性和敏感性均比利用肿瘤抗原检测肿瘤要高得多。很多肿瘤相关抗原不仅在肿瘤患者体内存在，在正常人体内也存在，因此检测肿瘤相关抗原作为诊断依据可信性差。而肿瘤自身抗体在正常人体内含量很低检测不到或根本不存在，若体内肿瘤自身抗体水平明显增高，则表明体内存在异常免疫情况，表明体内相关抗原水平发生波动，预示疾病的存在或原有疾病加重。近年来的研究表明，在恶性肿瘤体积发展到可用现代影像学技术检出之前3-5年，患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原自身抗体。因此，检测血中肿瘤相关抗原自身抗体具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。是肿瘤临床诊断领域的重点发展方向之一。在国外已有诊断肺癌和乳腺癌的早期诊断试剂盒市售。然而，目前所报道的自身抗体检测方法敏感度低，特异性差，假阴性比率可高达50%以上。其主要原因是由于每一种肿瘤相关抗原自身抗体在癌症患者中的阳性检测率平均在10%左右。如何提高诊断试剂敏感度是当前需要亟待解决的关键问题。比较行之有效的方法是寻找新的可充当肿瘤标志物的自身抗体，然后与现有已知的肿瘤相关抗原自身抗体组合成具有敏感度高和特异性强的诊断试剂盒。IMP1基因定位于11p13，包含10个外显子，48个氨基酸。IMP1和p62蛋白在氨基酸水平有大约66%到70%的同源性，属于同一mRNA结合蛋白家族。IMP1主要在早期胚胎发育阶段和妊娠中期表达，其与胰岛素样生长因子II（IGF-II）的不同转录物结合，参与调节IGF-IImRNA的定位、稳定、反转录及翻译，常常在许多肿瘤中过度表达，被认为是一种癌胚蛋白。IGF-II是一种包括67个氨基酸的单链多肽，IGF-II基因中含有四个启动子及九个外显子，其转录过程是由多个启动子调节每个启动子与不同的外显子非翻译调控区相关联，从而产生不同的转录产物。转录产物在胚胎期和成年期均特异性表达，其编码的IGF-II基因为一胚胎源性的生长因子，具有促进胚胎的发育及在细胞生长过程中促进细胞分裂增殖等作用。IGF-II转录异常参与了许多疾病及肿瘤的发生发展。许多研究表明，IMP1不仅与肿瘤的发生发展有关，而且与肿瘤的预后、转移有关，有望成为某些肿瘤的分子标记物及潜在的治疗靶点。基于IMP1在肿瘤组织和正常组织间表达的巨大差异和其在肿瘤发展中的重要作用，IMP1作为一个预测、预后指标和抗癌治疗靶点吸引了越来越多的关注。同时提示我们其在肝癌早期诊断的应用价值较好，以及作为潜在生物标志物的可能。本专利技术通过自行设计的IMP1抗原表位多肽，检测肝癌患者血清及血浆中自身抗体表达水平并开发相应的试剂，预测肝癌发生的危险性，并为制备肝癌早期诊断及预后预测试剂盒奠定基础。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是公开一种检测肝癌标志物IMP1自身抗体的抗原表位序列。本专利技术同时公开了IMP1抗原表位的用途。本专利技术提供的一种检测肝癌标志物IMP1自身抗体的抗原表位氨基酸序列为：H-PYGLIRGRIFFKIWPLSDFGFLRASPNGHRDC-OH其纯度>95%，pH>7.0。本专利技术所述的IMP1抗原表位多肽在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用。本专利技术利用自行设计的IMP1蛋白的线性多肽，采用ELISA法检测肝癌患者血清及血浆中抗IMP1蛋白的特异性自身IgG抗体。自身IgG抗体水平升高表明肿瘤患者体内IMP1蛋白的表达量增加，预示患者可能出现原发性或继发性肝癌，可以预测肝癌发生与复发的危险性，指导临床医生对肝癌的早期诊断及预后预测。抗原抗体的结合实际上只发生在抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间，两者在空间结构和空间构型上完全互补。因此抗原决定簇就可以代表整个蛋白与抗体结合的状态与亲和特性。另外，以重组蛋白为抗原，要经过载体构建、转染、表达、筛选、纯化等繁琐的过程，蛋白空间结构复杂，抗原表位不易暴露，因此抗原抗体结合的特异性差。此外，ELISA法的高灵敏性对纯化技术的稳定性要求极高，成本昂贵。专利技术人遵循以下原则设计线性多肽抗原：①选择细胞膜蛋白表面区域；②选择不形成a-helix的序列；③两端的肽段比中间的排列合理；④避免蛋白内部重复；⑤避免同源性强的肽段；⑥序列中尽量避免Cys和Glu，不可以有太多的Pro，但有1-2个Pro利于肽链结构稳定，对产生特异性抗体有益。此外，该多肽抗原必须含有人类白细胞二类抗原(HLA)系统的限制性表位，包括HLA-DR,HLA-DPandHLA-DQ的限制性表位。这些表位可被90%以上华人群体的HLA二类抗原系统所识别。基于以上抗原设计原则及IMP1蛋白的生物学特性，本专利技术利用生物信息学和多个表位预测模拟软件，分析与抗原性相关的参数，设计了的线性氨基酸序列。IMP1线性多肽抗原由32个氨基酸残基组成，共含8个重叠表位，可检测至少8种单克隆抗体，具有高度的特异性。ELISA法检测抗原表位我们采用ELISA方法，对收集的血液进行检测，并得到各样本OD值进行分析。质控各样本设双复孔，取平均OD值。OD值离散度判定：离散度=OD1-OD2/OD1+OD2，离散度≤0.1，为有效结果；离散度>0.1，为无效结果。取100份健康人血清等体积混合作为质控血（Qualitycontrol,QC），代表人群的普遍情况，每板均设2个QC血浆孔，以QC血浆孔的OD值变异水平判定结果的稳定性，批间变异CV=所有批次QC孔SD/所有批次QC孔OD均值<20%。批内变异CV=每日各板QC孔SD/每日各板QC孔均值<10%。数据分析采用SPSS17.0forwindows进行统计学分析。采用特异结合指数（Specificbindingindex，SBI)来判定IMP1抗原多肽与血浆自身抗体的结合程度，SBI=IMP1OD值–NCOD值/QCOD值–NCOD值，NC为各样本的阴性对照。利用t检验分别比较恶性肝癌组与健康对照之间SBI值之间的差异，a=0.05。ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式（分界值或决定阈），以真阳性率（灵敏度）为纵坐标，假阳性率（1-特异度）为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在AU>0.5的情况下，AU越接近于1，说明诊断准确度越好。ROC曲线将灵敏度与特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准确性的综合代表。该专利技术采用Analyse-itforMicrosoftExcel软件绘制ROC曲线，计算曲线下面积（AU），判定灵敏度和特异度。本专利技术应用IMP1抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测肝癌标志物IMP1抗原表位多肽，其特征在于：氨基酸序列为 H‑ PYGLIRGRIFFKIWPLSDFGFLRASPNGHRDC ‑OH其纯度>95%，pH>7.0。

【技术特征摘要】
1.一种检测肝癌标志物IMP1抗原表位多肽，其特征在于：氨基酸序列为H-PYGLIRGRIFFKIWPLSDFGFLRAS...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙世龙，刘颖，
申请(专利权)人：孙世龙，
类型：发明
国别省市：吉林;22