本发明专利技术公开了一种检测VHL基因大片段缺失的杂交探针及检测方法与试剂盒，涉及基因检测领域。本发明专利技术公开的杂交探针上标有荧光信号，由具有SEQ ID NO.1～6所示的碱基序列的探针引物制备得到。本发明专利技术检测方法包括：利用已采集的待测样本制备细胞涂片；将所述杂交探针置于杂交液中与所述细胞发生杂交反应，获得杂交产物；洗涤所述杂交产物，并进行细胞核染色处理，获得核染色后的细胞涂片；通过荧光显微镜观察所述核染色后的细胞涂片，判断待测样本的DNA是否发生了VHL基因大片段缺失。本发明专利技术的试剂盒，包括杂交探针。本发明专利技术提供的杂交探针特异性强，灵敏度高，检测方法简单，试剂盒成本低，可以快速、准确的检测VHL基因大片段的缺失。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测领域，尤其涉及一种用于检测VHL基因大片段缺失的杂交探 针及检测方法与试剂盒。
技术介绍
VHL基因（M頂编号608537)定位于3p25-26,全长10KD，包含三个外显子和两个内 含子，可转录形成两种mRNA。包含三个外显子转录产物的mRNA翻译出p30 (213个氨基酸） 和pl9 (159个氨基酸）蛋白。pl9是VHL基因第二转录起始位点（54号密码子）转录形成 的异构体，与p30功能相似。VHL基因突变方式多样，包括点突变、大片段缺失、小片段缺失或插入、剪切位点突 变等。目前检测VHL基因突变最常用的方法是PCR直接测序，确诊率为38 %~80 %，但PCR 测序检测技术只能检测点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变，不能检测VHL基因大片 段缺失。 近年来，国内外用于VHL基因大片段缺失检测的方法包括SoythernBlot、MLPA、 RT-PCR及MPQFM-PCR等。SouthernBlot和MLPA具有检测方法操作繁琐，价格昂贵，不 适于临床推广应用的缺陷。RT-pcr、mpqfm-pcr虽操作简单，但诊断效率却有限。而荧光 原位杂交在诊断基因大片段缺失上，兼有诊断效率高且适合临床推广的特点，因此，我们可 利用荧光原位杂交来诊断VHL基因大片段缺失，解决现有VHL基因大片段缺失检测效率有 限和推广困难的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供了可用于VHL基因大 片段缺失检测的杂交探针、检测试剂盒和检测方法。 为实现本专利技术的目的，本专利技术一方面提供一种用于快速检测VHL基因大片段缺失 的杂交探针，其上标有荧光信号，由具有SEQIDNO. 1~6所示的碱基序列的探针引物进行 PCR制备得到。 其中，所述由具有SEQIDNO. 1~6所示的碱基序列的探针引物进行PCR制备得 到的杂交探针的大小为300-1000bp。 进一步优选地，所述由具有SEQIDNO. 1~6所示的碱基序列的探针引物进行PCR 制备得到的杂交探针的大小为300-800bp。 进一步优选地，所述由具有SEQIDNO. 1~6所示的碱基序列的探针引物进行PCR 制备得到的杂交探针的大小为300-500bp。 为实现本专利技术的目的，本专利技术再一方面提供一种应用如SEQIDNO. 1~6所示的 碱基序列的杂交探针引物合成的杂交探针检测VHL基因大片段缺失的方法，包括：利用已 采集的待测样本制备细胞涂片；将所述杂交探针置于杂交液中与所述细胞发生杂交反应， 获得杂交产物；洗涤所述杂交产物，并进行细胞核染色处理，获得核染色后的细胞涂片；通 过荧光显微镜观察所述核染色后的细胞涂片，判断待测样本的DNA是否发生了VHL基因大 片段缺失。 其中，所述待测样本是具有细胞核的细胞，可以是外周血、组织标本、尿液、脊髓及 其他含有VHL基因的具有细胞核的样本。 其中，所述荧光原位杂交探针的浓度是约8-20ng/y1。 优选的，所述荧光原位杂交探针的浓度是约10_15ng/y1。 其中，所述杂交反应的共变性温度是70-80°C，共变性反应时间是5-10min。 优选地，所述杂交反应的共变性温度是73-76°C，共变性反应时间是7-8min。 其中，所述杂交反应的杂交温度是40-46°C，杂交时间是14-18h。 进一步优选地，所述杂交反应的杂交温度是42-44°C，杂交时间是16h。 其中，所述应用如SEQIDNO. 1~6所示的碱基序列的杂交探针引物对1-3检测 VHL基因大片段缺失的方法还包括制备荧光原位杂交探针。 其中，所述制备荧光原位杂交探针包括：在人类基因组中筛选用作FISH探针的 VHL基因序列，通过克隆引物对4-6获得目的基因片段；将得到的基因片段连接到质粒中， 获得含有目的基因片段的质粒；将所述质粒在大肠杆菌中进行扩增，提取质粒后，得到质粒 溶液；利用探针引物、荧光原料和所述质粒溶液制备具有荧光染料标记的荧光原位杂交探 针。 其中，所述制备细胞涂片过程包括：分离待测样本中的细胞，经磷酸盐缓冲液洗涤 和KC1低渗处理后，用固定液固定所述细胞的形态，制成细胞涂片；将所述细胞涂片进行老 化处理，经胃蛋白酶消化处理后，进行酒精梯度脱水，得到细胞涂片。 其中，所述克隆引物对4-6如SEQIDN0. 7-12所示的碱基序列，包括： 克隆引物对 4F:f5'-aaccttagaggggcgaaaaaR:5'-gcttcagaccgtgctatcgt克隆引物对 5F:5'-aacctttgcttgtcccgataR:5' -ttatcagagtgggtggcaca克隆引物对 6F: 5'-gcaaagcctcttgttcgttcR:5, -cagtcttcccaaagcaggag〇 其中，所述通过克隆引物对4-6获得目的基因片段的反应体系是 反应物 体积 PC'Rmix 25(.ii DNA模板 lOOng 引物 扣1 ddH：0 ^i|i： 总体积 其中，反应体系中所述的引物包括克隆引物4、克隆引物5、克隆引物6。 其中，所述通过克隆引物对4-6获得目的基因片段反应条件是：94°C预变性 lOmin，94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 60s，30 个循环，72°C复性 7min，4°C保存。 其中，所述将得到的基因片段连接到质粒中的反应体系是：T-vector0.7y1，PCR 产物5y1，T4连接酶1y1，T4Byffer1y1，ddH20余量，总体积10y1。其中，所述将得到 的基因片段连接到质粒中的反应条件是：在室温条件下反应2h。 其中，所述探针引物对1-3如SEQIDNO. 1-6所示的碱基序列，包括：探针引物 1 5'-agtaacgagttggcctagcctcg 5?-cgtcttcttcagggccgtactc 探针引物 2f5'-gtactgacgttttactttttaaaaagataagg 5?-catgctctacacattgttctcctgg探针引物 3 5'-gcattgcacatcaacggat 5' -cagtcttcccaaagcaggag 其中，所述利用探针引物、荧光原料和所述质粒溶液制备具有荧光染料标记的荧 光原位杂交探针的反应体系为： 反应物 体积： X〇*PCRBluffer ：5：^1 2.5mMdATP 5am 2.5niMdCTP 5mii 2,5mMdGTPSnm 2.5mMdTTP 2.Snm Fluorescein-dUTP 2.5nm 貭粒 Ifll 引物 2(il Taq'酶 0.5卜d ddH20 余量 总休积 50(4 其中，所述利用探针引物、荧光原料和所述质粒溶液制备具有荧光染料标记的荧 光原位杂交探针的反应条件为：94°(：预变性21^11，94°(：变性3〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸 458,30个循环，72°(：复性1〇111111，4°(：保存。 其中，所述固定液是由体积比为3:1的甲醇和冰醋酸配制而成。 其中，所述杂交液是是由体积比为5:1:1:3的甲酰胺、20xSSC、硫酸葡聚糖和水配 制而成。 其中，所述老化处理是将所述细胞涂片在56°C条件下在烤片本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于快速检测VHL基因大片段缺失的杂交探针，其特征在于，杂交探针上标有荧光信号，由具有SEQ ID NO.1～6所示的碱基序列的探针引物进行PCR制备得到。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：龚侃，彭双鹤，李腾，王江宜，宁向辉，
申请(专利权)人：北京大学第一医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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