一种发酵生产脂肽类生物表面活性剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵生产脂肽类生物表面活性剂的方法，将枯草芽孢杆菌固定化于固体材料上，采用双阶段pH调控连续批次发酵工艺，有效提高了生产表面活性剂的效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于发酵
，涉及固定化枯草芽孢杆菌生产生物脂肽类表面活性剂 的方法，特别涉及利用该菌株连续发酵生产脂肽类生物表面活性剂的双阶段pH调控方法。
技术介绍
脂肽是由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链组成的一类化合物，其含有7-10个氨基 酸组成的肽链和羟基脂肪酸链或胺基脂肪酸链，其中脂肪酸上的羟基或胺基与肽 链氨基酸上的羟基结合形成内酯键或酰胺键，使肽链闭合形成环状脂肽。由于脂肽具有特 殊的化学组成与两亲分子结构，因此在医药、食品、农业及微生物采油等领域有广阔的应用 前景。通过微生物发酵生产可降解生物表面活性剂已成为国际生物工程领域中的一个新兴 课题。Arima于1968年首次发现，枯草芽抱杆菌能产生具 有抗生素作用的环状脂肽化合物，为结晶状脂肽类表面活性剂，商品名为表面活性素 (Surfactin)。此后，研究人员通过不同的分离技术和结构鉴定手段，发现了多种脂肽表面 活性剂surfactin的结构类似物。自被发现以来，表面活性素的表面活性一直最强，是迄今 报道效果最好的生物表面活性剂之一(食品工业科技，2008, 29(11) :296-298)。 脂肽类生物表面活性剂主要是通过微生物发酵方法制备，其生产菌一般是革兰氏 阳性芽孢杆菌。一般的脂肽类表面活性剂生产菌的产量较低，其产量均小于1. 〇g/L，少的甚 至在0.lg/L以下，要能达到较好的工业应用，通常需要对生产菌进行高产突变株的诱变选 育和发酵工艺优化，目前，国内外研究者在诱变育种、培养基优化及发酵调控等方面开展了 大量研究。 为提高表面活性素的产量，科学工作者尝试了多种发酵方式提高surfactin产 量。Yeh等研究了活性炭、琼脂、膨胀粘土添加到培养液中对surfactin发酵的影响，结果 表明添加25g/L的活性炭时，surfactin产量达到最大，是没有对照样的36倍（YehMS， WeiYH，ChangJS.EnhancedProductionofSurfactinformBacillussubtilis byAdditionofSolidCarriers.BiotechnologyProgress, 2005， 21(4): 1329-1334.)。汪文静等人研究了添加凹凸棒、活性炭、纱布等几种大表面积基质对发酵抗 菌脂肽的影响，观察到芽孢杆菌在凹凸棒表面形成的生物被摸组织致密，粘附稳定，抗菌脂 肽产量最高；而活性炭、纱布的生物被膜态菌体少于凹凸棒表面，产量也有所下降。 为了实现其工业化应用，研究者利用表面活性素在发酵过程中产生大量气泡的性 质，采用泡沫分离技术分离提纯表面活性素。ChienYC等人借助泡沫分离技术收集发酵 过程中产生的泡沫，泡沫破碎液中的生物表面活性剂的浓度是残留发酵液中的50倍左右； 同时，其产量也有相应的提高（ChienYC,SimonCB,RichardCD,Batchproduction ofbiosurfactantwithfoamfractionationJournalofChemicalTechnologyand Biotechnology, 2006， 81， 1923-1931)。 现有发酵方法生产生物表面活性剂产量较低，分离成本较高，工业化生产不成熟。 专利技术人在前期工作中发现，利用枯草芽孢杆菌生产表面活性素（Surfactin)的时候，其表 面活性素的产生与分泌与pH值存在密切的关联关系。 因此，在此基础上开发发酵调控的方法及发酵方式会成为其工业化应用的关键 点。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题在于，现有发酵方法生产生物表面活性剂产量较低，技 术不成熟。 针对现阶段生物表面活性剂的生产问题，本专利技术的技术目的之一为提供了一种发 酵生产脂肽类生物表面活性剂的方法，以提高目标产品的产量以及生产效率。 为了实现技术目的，本专利技术的技术方案为： 本专利技术所述的方法，采用如下步骤进行发酵（1)取产脂肽类生物表面活性剂的菌株进 行固体斜面活化培养；（2)将上述活化培养获得的菌株进行液体扩大培养，扩大培养级数 为1-3级；（3)将扩大培养的菌体进行液体发酵；其中：所述液体扩大培养基中添加了固定 化细胞载体，还包括了在液体发酵体系中固定化于发酵反应罐上的固定化细胞载体，且任 一所述固定化细胞载体为毛巾、纱布、海藻酸钠、活性炭、膨胀土、琼脂、凹凸棒中的一种。 对于固定化细胞载体的应理解为可以从发酵液体系中吸附聚集细胞，且可以采用 现有技术的方式分散存在于摇瓶体系，或者采用现有固定技术固定于发酵罐中，例如，在一 个优选的实施方式中，将毛巾固定于发酵罐的挡板上，经过此种固定方式，固定化细胞载体 可以有效聚集细胞，因此可以避免在生物表面活性产生时通过泡沫带出大量的菌体。 本专利技术所述的方法，其中，所述液体发酵的过程采用连续批次发酵的方法进行生 物表面活性剂的生产，且连续批次发酵的批次生产数为2-8批次。 本专利技术所述的方法，其中，在连续操作条件下，将每次批次发酵结束后的发酵液与 固定化细胞分离，并补充新的发酵液。 对于连续批次发酵的理解应理解为在首次发酵时，采用常规的方法接入菌种并进 行发酵；在第一个发酵批次周期结束以后，分离倒出发酵液体，保留已固定化于固定化载体 上的细胞，并继续补进第二个批次的发酵培养基，循环操作直至整个发酵培养周期的结束。 本专利技术所述的方法，其中，在连续批次发酵中，每个发酵批次发酵周期为24h;每 个周期的前2~12h，pH控制在2~6,剩余的12~22h，pH控制在5~9。对于分阶段的pH值应理解为，在整个周期的发酵控制中，环境对于菌体的调节采 用了pH值调节的方案，即采用常规的pH调节方式实现本方案的pH值调节，如至少在每个 发酵周期的前2h内，维持发酵体系pH值在2-6,优选4-6的范围，剩余时间在发酵周期内 pH值控制为5-9 ;优选6-8 ;再如至多在发酵周期的前12h内，维持发酵体系pH值在2-5,优 选2-4的范围，剩余时间在发酵周期内pH值控制为5-9 ;优选7-9 ;其中，更优的低pH(如 pH2-4)的维持时间与高pH值的维持时间的确定为本方案中已经公开的技术。 本专利技术所述的方法，其中，扩大培养的培养条件为，30~45°C、pH7.0~8.0,培养时 间为12~24小时。 本专利技术所述的方法，其中，扩大培养的接种至发酵培养的接种量为体积占比为接 种液占发酵液2~10%体积。 本专利技术所述的方法，其中，发酵培养的条件为搅拌转速200~1000转/min;通气量 0. 1~1VVM;装液量为发酵罐总体积40%~80% ;培养温度为30~45°C。 本专利技术所述的方法，其中，所述扩大培养基或发酵培养基含有甘油、玉米糖化醪、 糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎杆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种作为碳源；含有黄豆 饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉、酵母膏、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾、 尿素、氨水中的一种或几种作为氮源；含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二 钾、磷酸氢二铵中的一种或几种作为无机盐，优选磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钾；含有铜、 钙、铁、锌、锰、镁等微量元素。其中所选碳源浓度以培养基中的葡萄糖计，其含量为l-200g/ L，优选20-4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵生产脂肽类生物表面活性剂的方法，采用如下步骤进行发酵（1）取产脂肽类生物表面活性剂的菌株进行固体斜面活化培养；（2）将上述活化培养获得的菌株进行液体扩大培养，扩大培养级数为1‑3级；（3）将扩大培养的菌体进行液体发酵；其特征在于：所述液体扩大培养基中添加了固定化细胞载体，还包括了在液体发酵体系中固定化于发酵反应罐上的固定化细胞载体，且任一所述固定化细胞载体为毛巾、纱布、海藻酸钠、活性炭、膨胀土、琼脂、凹凸棒中的一种。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李霜，黄和，刘强，徐晴，江凌，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32