本发明专利技术涉及基因工程技术领域，提供了一种增强桑树抗病能力的miRNA的克隆及其应用，该miRNA命名为mul-miRn2，其具有序列表中SEQ.ID.NO.1所示的RNA序列，其前体RNA和编码基因序列分别具有序列表中SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列。在桑树中过表达SEQ.ID.NO.1所示的miRNA，可培育出对桑黄化型萎缩病和桑疫病具有较高抗性的转基因桑树；本发明专利技术的mul-miRn2为培育抗病桑树新品种提供了新的基因资源，该基因可用于桑树或其他植物抗病性育种研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，提供了一种增强桑树抗病能力的miRNA的克隆及 其应用。
技术介绍
桑树在我国已有数千年栽培历史，桑树作为家蚕的饲料树种，是蚕丝产业的重要 物质基础。桑树除可供采叶养蚕外，桑叶、桑椹、桑枝、桑皮、桑根还具有很高的食用、药用和 饲用价值。另外，桑树作为生态树种在防沙治沙、石漠化治理、水土保持、盐碱地治理、退耕 还林等方面也发挥了重要作用，其经济和生态价值越来越受到重视。蚕业生产中为了养蚕 需要对桑树进行剪伐采叶，持续的剪伐采叶易造成树势衰败，增加受到病虫害侵染的风险。 我国已发现的桑树病害有100余种，能为害成灾的约40种。其中桑树黄化型萎缩病和桑疫 病一直是危害桑树的重要病害，在我国各蚕区都有发生，往往造成桑叶产量和质量的降低， 对蚕桑产业的发展产生不利影响，同时也限制了桑树药用、饲用和生态价值的实现。由于桑 蚕对农药敏感，常规的农药难以在桑园施用，因此，培育广谱抗病新品种是解决这一问题的 根本途径之一。 为了减少由环境胁迫造成的伤害，植物在进化过程中发展了复杂的响应机制，可 以在转录、转录后和翻译后水平上调控基因的表达，增强自身抗性。miRNAs在植物体内作 为基因表达的重要调控因子，能在转录和转录后水平上调苄基因表达，其功能几乎涉及到 生长发育、信号转导以及环境响应等生命进程的各个方面。病原菌在侵染植物的过程中会 诱导宿主产生大量小分子RNA，其中一部分被证实为miRNA，植物也可以通过miRNA调控某 些抗病途径中的关键基因来抵御病菌的入侵，在植物基础防御及生物胁迫响应中具有重 要的作用。miR393是第一个被报道在植物病原相关分子模式触发免疫过程中具有作用的 miRNA，该miRNA可以通过抑制生长素信号通路来提高植株对外源细菌侵染的抵抗能力。尽 管目前国内外已从多种植物中克隆获得多个miRNA基因应用于分子育种并有多项研究成 果申请了专利，但与植物抗病性相关的miRNA的专利仅见有陈浩等专利技术的"叶片特异性表 达人工microRNA提高水稻对白叶枯病抗性的方法"（中国专利CN101565701A)，公开了一 条21nt的人工设计的microRNA序列，并表明该miRNA在水稻叶片中特异性地表达可以增 强转基因水稻对白叶枯病的抗性。方荣祥等专利技术的"培育抗病水稻的方法及其专用载体和 启动子"（中国专利CN103194484A)，公开了一种培育抗病水稻的方法及其专用载体和启动 子，将miR393的编码基因及驱动其表达的诱导型启动子导入目的植物，获得对水稻白叶枯 病具有较高抗性的转基因植物。孙传宝和何玉科专利技术的"抑制植物病毒的人工miRNA及其 构建和用途"（中国专利CN102559666A)，公开了根据侵染植物的病毒中基因沉默抑制子的 核酸序列设计出了沉默效果优异的寡核苷酸，这些寡核苷酸导入到植物体内后，在病毒侵 染植物时能够在植物体内形成miRNA，与病毒基因沉默抑制子的mRNA结合，影响mRNA的转 录，从而达到抑制病毒的效果。王兴军等专利技术的"利用人工microRNA提高水稻抗黑条矮缩 病的方法及其专用双链RNA"（中国专利CN102676510A)，公开了一种利用人工miRNA提高 水稻抗黑条矮缩病的方法及其专用双链RNA。但关于miRNA在桑树抗病育种中的作用，目前 还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人针对上述现有技术的情况，提供了一种增强桑树抗病能力的 miRNA的克隆及其应用，该miRNA命名为mul-miRn2,其具有序列表中SEQ.ID.NO. 1所示的 RNA序列，其前体RNA和编码基因序列分别具有序列表中SEQ.ID.NO. 2和SEQ.ID.NO. 3所示 的核苷酸序列。在桑树中过表达SEQ.ID.NO. 1所示的miRNA，可培育出对桑黄化型萎缩病和 桑疫病具有较高抗性的转基因桑树；本专利技术的mul-miRn2为培育抗病桑树新品种提供了新 的基因资源，该基因可用于桑树或其他植物抗病性育种研究。 专利技术人首先提供了一种增强桑树抗病能力的miRNA，该miRNA命名为mul-miRn2， 其具有序列表中SEQ.ID.NO. 1所示的RNA序列； 其前体RNA具有序列表中SEQ.ID.NO. 2所示的核苷酸序列； 其编码基因序列为SEQ.ID.N0. 3所示的核苷酸序列； 除了如SEQ.ID.N0. 3所示的核苷酸序列之外，还包括能够在植物体内编码SEQ. ID.N0. 2所示的miRNA前体RNA序列并且与SEQ.ID.N0. 3所示序列具有90%以上相似度的 核苷酸序列；此序列被导入植物细胞后可被转录成miRNA前体，所述的miRNA前体可在植物 细胞中剪切且加工成成熟的miRNA，因此也在本专利技术的保护范围之列。 本专利技术构建了桑树mul-miRn2基因的超表达载体pBI121-mul-miRn2,将该表达载 体转入农杆菌GV3101感受态细胞，筛选转化子，采用叶盘转化法转化桑树。对获得的转基 因桑树植株进行抗病性分析表明，转基因桑树植株能显著提高对黄化型萎缩病和桑疫病的 抗性，具有良好的应用前景。 本专利技术涉及一种植物表达载体，包含有如SEQ.ID.NO. 1或SEQ.ID.N0. 2或SEQ. ID.NO. 3所示的核苷酸序列，用于提高桑树对黄化型萎缩病和桑疫病的抗性。 本专利技术提供了桑树mul-miRn2基因在植物中应用的方法，可提高植物的抗病能 力。步骤为： 1)将mul-miRn2基因序列置于CaMV35S强启动子之下，构建植物表达载体 pBI121-mul_miRn2 ; 2)将构建的表达载体pBI121-mul-miRn2转化农杆菌感受态细胞，筛选出转化子； 3)利用2)获得的转化子转化桑树，得到转mul-miRn2基因桑树。 基于上述的发现，专利技术人进一步通过基因工程技术在桑树中超量表达mul-miRn2 基因，可培育出对桑黄化型萎缩病和桑疫病具有较高抗性的转基因桑树；本专利技术的 mul-miRn2为培育抗病桑树新品种提供了新的基因资源，该基因可用于桑树或其他植物抗 病性育种研究。【附图说明】 图1为mul-miRn2前体序列的二级结构图， 本专利技术提供的miRNA来源于桑树，命名为mul-miRn2,其前体序列可折叠成一种稳 定的莖环结构，属于miRNA前体典型的二级结构，符合miRNA前体的结构特征； 图2为桑树mul-miRn2基因植物超表达载体pBI121mul-miRn2的构建图； 图3为超表达载体pBI121mul-miRn2经BamHI和SacI双酶切的电泳图谱， 图中M:MarkerDL2000;P:酶切产物， 由图可知我们已经将桑树mul-miRn2基因核苷酸序列插入到植物表达载体 PBI121中，成功构建了mul-miRn2基因植物超表达载体； 图4为转基因植株的PCR鉴定结果示意图， 图中WT:野生型桑树对照；L1-L5:转基因桑树阳性株系；M:MarkerDL2000; 以筛选出的阳性植株的DNA为模板，根据35S启动子序列设计一对特异引物进 行相应转基因株系的PCR扩增，结果均能扩增到530bp左右条带，说明我们已成功地将 mul-miRn2基因转入桑树体内，并获得了转基因植株； 图5为m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种增强桑树抗病能力的miRNA，其特征在于：该miRNA命名为mul‑miRn2，其具有序列表中SEQ.ID.NO.1所示的RNA序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冀宪领，盖英萍，张华梁，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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