本发明专利技术提供一种人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物以及试剂盒，所述人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物包括ACTB、NDRG4和TFPI2三种基因的捕获引物、甲基化引物和探针。本发明专利技术能够用于结直肠癌的检测、辅助诊断以及复发的预测、疗效评价等方面，具有灵敏度高、特异性强、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物及试 剂盒。
技术介绍
结直肠癌（colorectalcancer，CRC)是胳床上常见的恶性肿瘤之一，在世界范 围内，结直肠热的发病率和病死率均在不断上升，在全世界排名第临床诊衔买践表明， 早期的结直肠癌无明显的临床症状，但是手术治疗可使早期结直肠癌得到根治，对于I、II期的结直肠癌患者，外科手术的5年生存率分别达到90%和75%，而对于晚期患者则不足 10%。且晚期结直肠癌经化放疗联合分子靶向治疗后平均生存时间仍不足30个月。因此 通过对结直肠癌的早期筛查和诊断对提高肿瘤治愈率、降低肿瘤转移率和复发率具有十分 重要的意义。 结肠镜是发现早期结直肠癌的重要方式，然而它是一种侵入性检查，要求完全彻 底的肠道准备，迸行大规模筛查难度较大。而纤维结直肠镜对于直径小于5mm的病变漏诊 率高达到27%。大便潜血试验是一种非侵入手段，但是敏感性较差，在15--80 %左右，特异 性也较低。 众多研究表明，DNA甲基化发生在结直肠癌形成的早期甚至起始阶段，并且DNA甲 基化状态改变与结直肠癌的发生发展关系密切，贯穿整个肿瘤发生发展过程。以单个基因 甲基化为粪便MA筛查标记,检测大肠癌敏感性达38% -94%，检测大肠腺瘤的敏感性达 31% -70%，特异性达79% -100%。而且甲基化标记还具有稳定性强和容易检测的特性。 同日才，大量研宄表明，粪便既含有脱落的正常结直肠上皮细胞和游离的DNA，也含有大量从 结直肠癌上脱落的癌细胞和游离的癌DM;又由于肠道是碱性环境，有利于DNA的保存，使 得从粪便中提取的DM质量较好,因此粪便样本DNA甲基化检测作为一种检测性能较好、高 特异性和非侵入性手段，能根据其阳性结果对疑似病例进行迸一步检测，可作为筛查诊断 结直肠胂瘤的一种重要的辅助手段，具有很重要的筛查早期结直肠癌的临床价值。 目前己有大量文献报道了一系列在结直肠癌中甲基化程度异常的基因，如NDRG4、 TFP [2、SEPT9、BMP3和VIM等等。N_Myc下游调控基因4 (N-myc downstream-regulated gene 4，NDRG4,又名SMP-8或者BDM1)位于染色体16q21-q22" 3，有17个外显子，是一种抑癌基 因。近年来研宄认为NDRG4基因存在于结直肠癌肿瘤组织和体液中，且可能具有稳定性高、 可重生的特点，这为提高结直肠癌的早期筛查和诊断提供了一个全新的视角。Veerle和他 的同事发现NDRG4启动子的甲基化可作为生物标志物，羯于粪便样品检测直肠癌，敏感性 为61 %,特异度为93%。赵慧霞等从84例结直肠癌手术切除癌组织、癌旁组织及其术前粪 便、尿和血中提取DM,应用巢式甲基化特异性PCR检测NDRG4基因甲基化水平。组织因子途径抑制因子基因（tissuefactorpathwayinhibitor2,TFPI2)定 位于7q22区域，包含5个外显子，是Kunitz型丝氨酸蛋白质抑制物^对细胞外基质的降解 和重塑起到重要的作用。TFPI2可在体内多种组织广泛表达，在这些组织内一旦出现肿瘤， TFPI2的表达水平也会随之显著下降。有研究证实，与肿瘤产生相关的TFPI2表达水平减少 可能与其启动子的甲基化密切相关。己经有相关研究报道TFP]2可作为结直肠癌粪便MA 筛查的标志物之一。 在现阶段，采用PCR技术检测患者血清或粪便内的DM和检测微小RNA的浓度对 结直肠癌治疗监测和预后评价有一定的价值，但在应用于结直肠癌的早期诊断方面还很不 成熟，诊断准确率、特异性、有效性不高等缺点尚有待解决。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种操作简单快速、无创伤的结直肠癌检测标志物以及试剂 盒，具有定量、灵敏度高、特异性强、检测成本低、取材方便、样本易存放和无创伤性等优点。 为达到上述目的，本专利技术的技术方案是：人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物， 所述人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物包括ACTB、NDRG4和TFPI2三种基因的捕获引 物、甲基化引物和探针； +其中，H种基因的捕获引物分别是: 本专利技术还提供一种人NDRG4/TFFM:2基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述人 NDRG4/TFPI2基因甲基化检测试剂盒包括： 捕获试剂：NDRG4捕获液、TFPI2捕获液、ACTB捕获液、细胞裂解液、清洗缓冲液、捕 获洗脱液； 硫化纯化试剂：硫化剂、DNA保护液、结合液、磁珠、纯化漂洗液1、纯化漂洗液I丨:、 纯化漂洗液III、纯化洗脱液； 定量化检测试剂：NDRG4PCRMix、TFPI2PCRMix、ACTBPCRMix、标准品、阴性质控 品、阳性艇控品、聚合酶。 所述人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测试剂盒用于检测时的PCR程序如下：首先 95°C变性5分钟，然后95r变性20秒、60°C退火40秒，并进行50次循环,PCR循环过程中， 仪器升降温速度设定为L3°C/S，最后40°C维持30秒。 所述PCR结果在LightCyderd? 480II上进行NDRG4/TFPI2/ACTB的CP值分析， 用不同浓度梯度的标准品溶液剌作标准曲线，从标准曲线上得到相对应的拷贝数的对数 值，运用逻辑回归方程P= 〇? 795Xj.〇gN!)RG4+0. 218Xj.〇gTFP]2-0? 216Xj.〇gACTB+2. 601, value= 6?口([))/(1+6乂口(3)))，计算出得分。 所述PCR结果的分析具体如下： 1)PCK结果在UghtCycler? 480II上进行NDKG4/TFPI2/ACTB的CP值分析，以 扩增过程前3-15个循环荧光值的10倍标准差为_值，当荧光值超过阈值时的循环数则为Ct值；检测结果扩增曲线应为"S"型； 2)以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以Ct值作纵坐标，制备"Ct-Log拷贝数" 标准曲线； 3)根据样本的Ct值可从标准曲线上得到相应的Log拷贝数，再根据逻辑回归方 程： P- 0. 795XlogNDRG4H-0. 218XlogTFPI2-0. 216XIogACTB+2. 601?value-exp(P) / (l+exp(P)),计算出得分； 4)将得分与cut-off值进行比较： A、计算阳性质控品的SCORE值（P值），其结果大于0. 6i34，计算阴性质控品的 SCORE值，其结果小于0. 6134,可以继续分析； B、计算样本的SCORE值，若结果小于等于0. 6134,患肠癌风险性较低；SCORE大于 0。6134,患肠癌或者肠癌早期病变风险性较高，建议镜检确认。 本专利技术采周特定检测标志物结合荧光PCR方法定量测定人粪便样本中NDRG4和 TFM2基因甲基化程度。在人粪便样本液中加入一定量的裂解液，再加入羧基磁珠与氨基探 针偶联形成的捕获探针来捕获人粪便样本中NDRG4、TFPI2和ACTB基因。将捕获到的基因 通过转化液和DM保护液进行硫化处理，硫化产物再进行纯化。对纯化产物进行荧光PCR 检测，用不同浓度梯度的标准品溶液制作标准曲线。从标准曲线」::得到相对应的拷贝数的 对数值，运用逻辑回归方本文档来自技高网...
【技术保护点】
人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物，其特征在于，所述人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物包括ACTB、NDRG4和TFPI2三种基因的捕获引物、甲基化引物和探针；其中，所述三种基因的捕获引物分别是：捕获探针序列(5’‑3’)ACTB/5AmMC6/ACCCAGCACACAGTGGCAGACACAGGTTCACAGTNDRG4/5AmMC6/TCCCTCGCGCGTGGCTTCCGCCTTCTGCGCGGCTGGGGTGCCTFPI2/5AmMC6/CCTGGAGCAGAAAGCCGCGC所述三种基因的甲基化引物和探针的序列分别是：引物、探针序列(5’‑3’)ACTB(F)GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAACTB(R)AACCACAACCTAATAAAAAAAAACTB(PRO)VIC‑ACACACAATAACA‑MGBNDRG4(F)CAGGGTGTTTTTTAGGTTTCNDRG4(R)ACTTCCGCCTTCTACGCGNDRG4(PRO)FAM‑TCGCGGTTTTCG‑MGBTFPI2(F)GTTGGGTAAGGCGTTCGCTFPI2(R)CTCTCGCCCCGCATAAAACGTFPI2(PRO)FAM‑GTGCGCGGTCC‑MGB。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王弢，秦勇，刘广强，邱黎清，
申请(专利权)人：苏州工业园区为真生物医药科技有限公司，世济海南医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。