一种利用重组钝齿棒杆菌一步发酵法生产L-鸟氨酸的方法技术

通过大肠杆菌和钝齿棒杆菌之间的穿梭质粒pXMJ19，将来源于Bacillus cereus的精氨酸酶成功在精氨酸高产菌株C.crenatum SDNN403中表达。酶活测定结果表明，原始菌不具有精氨酸酶的活性，而重组工程菌的精氨酸酶酶活达到24.3U/mg。基于此工程菌株具有高产精氨酸和精氨酸酶的特性，研究了其以葡萄糖为底物，采用一步发酵法生产L-鸟氨酸。采用了发酵过程双阶段pH调控的策略，重组菌在第一阶段的在96h发酵过程中，共积累25.05g/L的L-精氨酸和9.86g/L的L-鸟氨酸。经过第二个阶段的发酵后，最终在108h内，共积累27.91g/L的L-鸟氨酸，而精氨酸的含量仅为0.95g/L。本发明专利技术方法生产L-鸟氨酸具有效率高，L-精氨酸和其他杂酸余量低，对于后期产物L-鸟氨酸的分离纯化更加容易。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到精氨酸酶基因的克隆表达获得重组工程菌，同时将该工程菌应用于 L-鸟氨酸的生产，属于生物工程和生物
技术背景 鸟氨酸是一种碱性氨基酸，易溶于水和乙醇，微溶于乙醚等有机溶剂。鸟氨酸接受 二分子NH4+和一分子C0 2形成一分子L-精氨酸。L-精氨酸亦可以在精氨酸酶的作用下被 水解成鸟氨酸和尿素。 L-鸟氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，是精氨酸和脯氨酸合成的重要前体物 质。同时L-鸟氨酸是人体内尿素循环的重要中间代谢产物，因此其对肝脏的解毒功能具有 重要的保障作用。L-鸟氨酸能够刺激体内生长激素的分泌，促进蛋白质的合成以及糖类和 脂质的分解代谢作用。L-鸟氨酸和其他氨基酸一起制成的复方氨基酸有很好的保肝护肝以 及激发病态下肝脏的活力的作用。联合使用L-鸟氨酸和苯乙酸能有效治疗肝性脑病，特别 是对于鸟氨酸循环障碍的患者，L-鸟氨酸能通过促进谷氨酰胺的合成和排泄来稳定的降低 患者血氨浓度。鸟氨酸a-酮戊二酸盐是很好的临床营养剂，促进外科创伤病人的恢复，改 善慢性营养不良，改善免疫功能。同时鸟氨酸和苹果酸盐和柠檬酸盐合用能够改善食品和 饮料的口味，减少苦味。在欧洲、美国以及日本，L-鸟氨酸都是作为膳食药物来销售的。 工业上L-鸟氨酸的合成包括化学合成法、微生物发酵法和L-精氨酸水解法。化 学合成作为早期L-鸟氨酸的生产方法，一般以丙烯醛、氰化氢、氨气、C02为原料合成L-鸟 氨酸。但效果并不是很理想，主要表现在于合成的步骤繁琐，产物得率低，而且得到的产物 是L-鸟氨酸和D-鸟氨酸的混合物，为后期的分离纯化带来很大的困难。同时化学法合成 L-鸟氨酸由于其环境的危害性，越来越不被现代工业所接受。生物合成法相对化学合成法 具有生产成本较低，环境污染小等优点而受到重视。微生物发酵生产L-鸟氨酸主要是通过 诱变或者基因工程的方法获得L-鸟氨酸高产菌株，以较为便宜的葡萄糖甚至是淀粉等最 为初始原料合成L-鸟氨酸。在这方面日本起步较早，上世纪五六十年代就开始鸟氨酸生产 的研究，主要以诱变筛选为主。1957年kinoshita等首先报道了利用谷氨酸棒状杆菌的瓜 氨酸或精氨酸的突变株发酵生产鸟氨酸。此后，okumuraheShibuya等人在这方面也做了大 量的工作总结出了具有精氨酸缺陷型及精氨酸氧肟酸盐抗性的谷氨酸棒杆菌以及具有精 氨酸和瓜氨酸，以及霉酚酸抗性等标记的柠檬酸节杆菌突变株用于工业生产中。国内陈宁、 刘树庆等人在1999年开始研究鸟氨酸的生产，并以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过硫酸二 乙酯和紫外线诱变定向选育出一种鸟氨酸生产菌，并通过发酵优化使得鸟氨酸产量达到 9. 85g/L。近几年，随着代谢工程技术的兴起，通过代谢工程改造的方法，鸟氨酸的发酵生产 取得一定的进展，其中，中山大学蒋玲艳等人以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过表达异源的 谷氨酸脱氢酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶，增加代谢流中NADPH的含量，使得L-鸟氨酸产量 得到提高，最终到14. 8g/L，而后蒋又通过代谢进化和代谢工程的方法，最后得到鸟氨酸的 产量为24.lg/L。通过发酵法进行鸟氨酸生产可以利用较简单的碳源，如葡萄糖等，成本非 常低廉，适合于工业的发展。 CorynebacteriumcrenatumSDNN403是实验室通过多级诱变筛选得到的一株 L-精氨酸高产菌株。在5-L发酵罐上，在96小时内能够利用葡萄糖获得35/L左右的L-精 氨酸（专利号ZL03112896. 3,本菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，保藏号CGMCCN0. 0890)。L-精氨酸可以在精氨酸酶的作用下水解形成L-鸟氨酸和 尿素。 本专利技术通过表达载体pXMJ19,实现了将来源于Baciluscereus的精氨酸酶基因 argl成功在C.crenatumSDNN403中进行表达，并利用此基因工程菌进行发酵，以葡萄糖为 底物，一步法生产L-鸟氨酸，实现了L-鸟氨酸的高效生产。
技术实现思路
本专利技术的主要研究内容：本专利技术利用分子技术成功构建了一株高效表达精氨酸酶 基因argl的工程菌株C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI。酶活测定结果发现该重组工程 菌具有较高的精氨酸酶活性。基于获得的基因工程菌，在5-L发酵罐内对该菌株利用葡萄 糖为底物采用双阶段pH调控的方法进行L-鸟氨酸生产进行了探究，并且对发酵条件，包括 诱导时间，MnS04添加量，双阶段pH调控的时机等进行了优化。在120g/L葡萄糖添加下， l〇8h内获得L-鸟氨酸的积累量为27. 9g/L。 本专利技术采取的技术方案： 将来源于菌株Bacilluscereus的精氨酸酶基因argl连接在表达载体pXMJ19上， 并转化至C.crenatumSDNN403得到重组菌株。以该工程菌为基础，以葡萄糖为底物，通过 发酵法并采用双阶段pH调控的策略生产L-鸟氨酸。同时对发酵条件进行优化。 1?重组菌株C.crenatumSDNN403/pXMJ19_argI的构建 (1)根据NCBI中Bacilluscereus全基因组核酸序列中argl基因序列，设计精氨 酸酶基因的PCR引物F和R。 F:5' -ACCCGAAGCTTATGAAAAAAGAAATCTCAGTTATTGG-3'(HindIII) R:5' -ACCGGGATCCTTATTTTAGTTTTTCACCGAATAAAG-3'(BamHI) 以Bacilluscereus基因组DNA为模板，以设计的F、R为精氨酸酶的上下游引物 扩增得到精氨酸基因片段argl。将获得的扩增片段通过胶回收试剂盒回收后以一定的比 例回收产物按一定比例与PMD18-Tvector过夜连解，获得重组质粒pMD18-T-argI。将获得 的重组载体pMD18-T-argI送至上海生工生物公司进行测序，测序结果正确后将该重组质 粒和表达载体PXMJ19分别经过HindIII和BamHI酶切后，回收相应的片段（argl片段和 酶切后的PXMJ19片段），然后将回收的片段在T4DNA连接酶的作用下进行连接，获得重组载 体pXMJ9-argI。将获得的该重组载体pXMJ19-argI通过电击转化的方法转入到C.crenatum SDNN403 中获得重组菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI。 2.重组菌株酶活力测定 酶活测定方法：配制0. 2M底物L-精氨酸（0. 2M碳酸盐缓冲液，pH9. 0)，取0. 9ml 底物溶液，加入〇.lml酶液，40°C反应lOmin。将酶反应液稀释相应的倍数，取lml稀释后 的反应液，用Chinard比色法测定反应液中L-鸟氨酸的含量。酶活定义单位为lmin催化 lumolL-精氨酸转化成L-鸟氨酸所需的酶量。 Chinard比色法：1ml标准液中依次加入1ml的冰醋酸，1ml混合酸（讳三酮溶液）， 于沸水浴中反应lh，测定515nm下的吸光度值。 3.重组菌以葡萄糖为底物一步发酵法产L-鸟氨酸的发酵条件优化将获得的重组菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI转接到LBG培养基（LB+0. 5% 葡萄糖）活化培养两次后，以10%的转接量转接到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型重组表达载体的构建，其特征是以Bacillus cereus基因组DNA为模板，扩增得到精氨酸基因argI，将其克隆到表达载体pXMJ19上，构建重组表达型质粒pXMJ19‑argI。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，王梅洲，徐美娟，张显，杨套伟，
申请(专利权)人：江南大学，江南大学如皋食品生物技术研究所，如皋江大食品生物技术研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32