一种细胞生产(S)- 4-甲苯丙酸甲酯的方法技术

技术编号:12426723 阅读:69 留言:0更新日期:2015-12-03 11:55
一种近平滑假丝酵母细胞生物催化制备(S)-3-(3-氟苯基)-3-羟基丙酸甲酯的方法,反应罐中加入磷酸盐缓冲液,用近平滑假丝酵母细胞进行生物催化反应,产品收率高,对映体过量率高,解决了现有方法生产的困难。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于制药工程
,特别涉及到近平滑假丝酵母细胞生物催化制备 手性医药中间体(S) -3- (3-氟苯基)-3-羟基丙酸甲酯的技术。
技术介绍
手性(S)-3_(3-氟苯基)_3_羟基丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品 和其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高等 优点,作为绿色高效制备手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值 的手性化合物。生物催化制备手性(S)-3_(3-氟苯基)_3_羟基丙酸甲酯具有很好的应用 前景。 生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续 发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物 催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆 分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原 酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物 氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4: 2:1。 生物还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子 经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于 辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的 同时免去了酶的分离纯化步骤。 (S) -3- (3-氟苯基)-3-羟基丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品的重 要手性砌块,。现有的方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高等严 重缺陷,难于进行工业化生产。本专利技术将采用生物细胞催化制备(S)-3-(3-氟苯基)-3-羟 基丙酸甲酯。
技术实现思路
本专利技术采用近平滑假丝酵母细胞催化制备(S)-3-(3-氟苯基)-3_羟基丙酸甲 酯,反应式如下:底物3-氟苯甲酰乙酸甲酯(1)经近平滑假丝酵母催化反应,得到产物(S)-3-(3-氟 苯基)-3_羟基丙酸甲酯(2)。有多种微生物可以催化此反应,经过大量实验筛选,最终确 定采用近平滑假丝酵母作为催化剂,因为其催化反应的效果最好,反应收率、对映体过量率 (ee%)均很高。 许多近平滑假丝酵母都可以进行生物催化此反应,然而,其效果不同,相差很大, 经实验,本专利技术选用近平滑假丝酵母菌株为ATCC28473,其催化反应效果最佳。 由于绝大多数氧化还原酶是辅酶NAD(P)H依赖型,而细胞本身所含有的辅酶量 可能较少,因此,进行氧化还原反应时,为促进辅酶再生,提高反应效率,在反应体系中 还添加辅助底物构成转化体系。常用的辅助底物种类较多,不同细胞所需的辅助底物不同, 效果差别很大,采用几种辅助底物组合,可以取得较好效果,需进行大量实验才能确定最佳 的辅助底物。本专利技术经过大量实验确定的辅助底物为:木糖36-39g/L、蔗糖25-28g/L、异丙 醇5-6%V/V(体积浓度)。 由于底物溶解度较低,所以,加入表面活性剂以增加底物的溶解度。 培养介质: 1、种子培养基成份为:酵母提取物10g/L,葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L,PH6. 8; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。 2、培养液成份:葡萄糖37-44g/L,木糖7-8g/L,玉米胚芽粉10-12g/L,酵母提 取物 4-5g/L,(NH4)2HP04 12-15g/L,KH2P0 4 6. 5-7. 5g/L.MgS04 ? 7H20 0? 7-0. 8 g/L,NaCl0.08-0.1g/L;pH6.8。 2、固体培养基成份:在液体培养基中加入2%的琼脂粉。 酵母细胞制备。近平滑假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液;发酵罐加 入培养液,121°C高压灭菌30分钟,冷却至29-30°C,将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵 罐,接种比例为6-6. 5%,通气比为0. 7-0. 9VAV分钟),29-30°C培养44-48小时,用过滤式 离心机离心得到湿酵母细胞,用作生物催化反应催化剂。 生物催化转化。底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液,pH为7.0,加入底物 3_氟苯甲酰乙酸甲酯,使底物浓度为80-90g/L。其他成份:麦芽浸膏22-26g,直链的10碳 醇聚氧乙烯醚为21-224g/L,木糖36-39g/L、蔗糖25-28g/L、异丙醇5-6%V/V(体积浓度), 121°C高压灭菌30分钟;冷却至29-30°C时,加入湿酵母细胞使浓度为80-84g/L,通气比为 0. 15-0. 16V/(V分钟),即每分钟通气量为0. 15-0. 16倍反应液体积,进行生物催化反应,反 应时间为60-64小时;反应结束后,滤出细胞,用乙酸乙酯萃取反应液,蒸出乙酸乙酯,得到 产物(S) -3-(3-氟苯基)-3-羟基丙酸甲酯,反应转化率98-99 %,产品收率96-97 %,对映 体过量率98. 5-99%。 本专利技术所开展工作包括菌株选择、催化反应条件优化(反应温度、通气量、pH)、反 应介质选择和浓度优化,包括底物浓度、麦芽浸膏含量、辅助底物组合、表面活性剂种类及 浓度等。 实施例1 种子培养基成份为:酵母提取物10g/L,葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L,pH6.8;配制 固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。 培养液成份为:葡萄糖37g/L,木糖78g/L,玉米胚芽粉10g/L,酵母提取物4 g/L,(NH4)2HP04 12g/L,KH2P0 4 6.5g/L.MgS04 . 7H20 0.7g/L,NaCl0.08g/L; pH6. 8〇 湿酵母细胞制备过程如下:近平滑假丝酵母ATCC28473经斜面、摇瓶培养,得到 种子液。1L发酵罐加入培养液,121°C高压灭菌30分钟,冷却至29°C,将近平滑假丝酵母 种子液接种至发酵罐,接种比例为6%,通气比为0. 7VAV分钟),29°C培养44小时,用过滤 式离心机离心得到湿酵母细胞,用作生物催化反应催化剂。 生物催化转化:0. 5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液,pH为7. 0,加入 底物3-氟苯甲酰乙酸甲酯,使浓度为80g/L,麦芽浸膏22g,直链的10碳醇聚氧乙烯醚为 21g/L,木糖36g/L、蔗糖28g/L、异丙醇6%V/V(体积浓度),121°C高压灭菌30分钟;冷却至 29°C时,加入湿酵母细胞使浓度为80g/L,通气比为0. 15V/(V分钟),进行生物催化反应,反 应时间为60小时;反应结束后,滤出细胞,用乙酸乙酯萃取反应液,蒸出乙酸乙酯,得到产 物(S) -3- (3-氟苯基)-3-羟基丙酸甲酯,反应转化率99 %,产品收率97 %,对映体过量率 98. 5%〇 实施例2 种子培养基成份为:酵母提取物10当前第1页1 2 本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种近平滑假丝酵母细胞生物催化制备 (S)‑3‑(3‑氟苯基)‑3‑羟基丙酸甲酯的方法,其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液, pH为7.0,加入底物3‑氟苯甲酰乙酸甲酯,使底物3‑氟苯甲酰乙酸甲酯添加量为80‑90 g/L,麦芽浸膏22‑26 g,直链的10碳醇聚氧乙烯醚为21‑224g/L,木糖36‑39g/L、蔗糖25‑28g/L、异丙醇5‑6%V/V,121℃高压灭菌30分钟;冷却至29‑30℃时,加入湿酵母细胞使浓度为80‑84g/L,通气比为0.15‑0.16V/(V分钟),进行生物催化反应,反应时间为60‑64小时;反应结束后,滤出细胞,用乙酸乙酯萃取反应液,蒸出乙酸乙酯,得到产物 (S)‑3‑(3‑氟苯基)‑3‑羟基丙酸甲酯,反应转化率98‑99%,产品收率96‑97%,对映体过量率98.5‑99%。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:冀雪张媛媛刘均洪
申请(专利权)人:青岛科技大学
类型:发明
国别省市:山东;37

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