本发明专利技术涉及一种纳米复合材料的电化学发光传感器的制备方法，包括制备Au@BSA纳米材料；利用戊二醛将鲁米诺交联到Au@BSA纳米材料表面，活化Au@BSA表面的羧基连接CEA抗体得到luminol-Au@BSA-anti-CEA；利用电沉积的方法，在工作电极裸玻碳电极表面电沉积金纳米层，将得到的复合材料luminol-Au@BSA-anti-CEA连接到电极表面，得到对抗原CEA具有靶向作用的电化学发光免疫传感器三个步骤。本发明专利技术快速、简便，且构建好的免疫传感器具有生物相容性好、特异性强、灵敏度高和检测范围宽等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种电化学发光传感器，尤其是涉及。
技术介绍
癌症是一种威胁人类身体健康的重大疾病。根据有关部门调查，恶性肿瘤高居我国人口死亡原因第二位。目前世界上仍缺乏有效的治疗手段来攻克癌症，如果能够实现对癌症有效的早期诊断，这对后期的治疗有着十分重要的意义，早期诊断是降低恶性肿瘤死亡率的主要途径。肿瘤标志物(Tumor Marker)是反映肿瘤存在的化学类物质，它们在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。临床诊断主要通过监测人体中肿瘤标志物的含量，以分析病人的病程、疗效、复发及预后等。现阶段检测肿瘤标志物的主要方法有:酶联免疫分析法、荧光免疫分析法、放射免疫分析法、化学发光免疫分析法和电化学免疫分析法等等。这些传统的分析方法虽然特异性强、灵敏度高，但也存在一些不足之处，如:操作流程复杂、耗时较长、后续数据处理复杂和仪器设备昂贵等等。因此，设计一种新型的免疫传感器，实现对低浓度肿瘤标志物的简单、快速、灵敏、准确检测，对保护人类健康有着相当重大的现实意义。中国专利CN104155445A公开了一种无标记电化学发光免疫传感器的制备方法及在肿瘤标志物的检测中的应用，利用新型微纳米材料NH4CoPOJt为基底，使得鲁米诺--过氧化氢发光体系的发光稳定性大大增强，同时利用棒状的金@银核壳纳米粒子作为生物模拟酶催化发光体系，从而制备了一种成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速、制备简单的检测肿瘤标志物的无标记电化学发光免疫传感器。上述组分中所用的基底材料是NH4CoPO4,相比较于该材料，本申请采用绿色方法合成的仿生材料AuOBSA作为传感器的固载体，成功固载上发光物质Iuminol和Ant1-CEA分子。将该复合材料材料共价键合到电沉积金纳米层修饰电极表面，使构建的传感器具有生物相容性好，导电性好，灵敏度高等特点。另外，对比该专利(CN104155445A)采用非共价地静电组装法制备无标记电化学发光免疫传感器，本申请采用共价键合法来构建电化学发光传感器，将有利于提高传感器稳定性测试性能。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种生物相容性好、特异性强、灵敏度高和检测范围宽的纳米复合材料的电化学发光传感器的制备方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现:—种纳米复合材料的电化学发光传感器的制备方法，采用以下步骤:(I)在室温搅拌下，将HAuCl4溶液和牛血清白蛋白溶液混合均匀，在剧烈搅拌的条件下，向混合的溶液中快速加入水合肼，反应完全之后，陈化12小时，将得到的产物离心分离后，用蒸馏水和乙醇交替洗涤，最终将洗后的产物冷冻干燥制备得到的AuOBSA纳米材料；(2)利用戊二醛的交联作用，将发光物质鲁米诺化学交联到AuOBSA纳米材料表面，进一步活化AuOBSA表面的羧基以连接CEA抗体，制备得到复合材料Iuminol-AuOBSA-ant1-CEA ；(3)利用电沉积的方法，在工作电极裸玻碳电极表面电沉积一层金纳米层，通过Au-S键的作用将得到的复合材料luminol-Au@BSA-ant1-CEA连接到电极表面，得到对抗原CEA具有靶向作用的电化学发光免疫传感器。步骤⑴中HAuCl4、牛血清白蛋白和水合肼之间的重量比是20?30:10?20:5?10。步骤(2)具体采用以下步骤:(2-1)将AuOBSA纳米材料与戊二醛混合后在室温的条件下，摇床反应2_4h，然后将离心得到的产物利用超纯水洗三次，去除未反应的试剂；(2-2)将得到的沉淀物超声溶解到pH为7.4的PBS溶剂中，加入鲁米诺溶液摇床反应2_4h，得到AuOBSA-1uminol纳米材料；(2-3)利用二次蒸馏水对得到的AuOBSA-1uminol纳米材料进行水洗，然后与EDC、NHS共同溶解在pH为7.4的PBS溶剂中，搅拌反应以活化AuOBSA-luminol表面的羧基，然后将Ant1-CEA加入到上述的混合溶液中，冰水浴的条件下搅拌过夜，将离心得到的产物利用二次蒸馈水洗净，即得到复合材料luminol-Au@BSA-ant1-CEA。步骤(2-1)中，AuOBSA纳米材料与戊二醛的重量比为30:1?2。步骤(2-2)中，沉淀物与鲁米诺的重量比为3:1?2。步骤(2-3)中，AuOBSA-1uminol纳米材料、EDC、NHS、Ant1-CEA 的重量比为 400 ?500:40:40:1 ?2。步骤⑶具体采用以下步骤:(3-1)用0.3 μ m及0.05 μ m Al2O3抛光粉对裸玻碳电极进行抛光，抛光好的电极在分别在二次蒸馏水和乙醇中各超声2min，除去残余在电极表面的Al2O3颗粒，再用N2吹干；(3-2)干燥的电极置于HAuCl4溶液中，在恒电位为-0.2V的条件下，在电极表面电沉积一层金纳米层，电镀时间为300s ；(3-3)常温下，将复合材料luminol-Au@BSA-ant1-CEA滴加到金纳米层表面，避光静置4h，利用Au-S的作用，将Iuminol-AuOBSA-Ant1-CEA纳米复合材料键合到金纳米层的表面。与现有技术相比，本专利技术采用绿色仿生材料AuOBSA作为固载体。绿色合成的AuOBSA具有生物相容性好，比表面积大和导电性好等特点，使构建好的免疫传感器具有特异性强、灵敏度高和检测范围宽等优点。本申请采用共价键合法来构建电化学发光传感器，将有利于提高传感器稳定性测试性能，除此之外，相比较其他方法而言，本实验构建传感器的方法快速、简便，为肿瘤早期诊断及其他肿瘤标志物的检测提供了新的方法。【附图说明】图1为制备得到的AuOBSA纳米微球的TEM照片；图2为不同的纳米粒子的Zeta电位图；图3为不同浓度的CEA(ng/mL)修饰的传感器的电化学发光强度图。【具体实施方式】下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明。实施例1实验试剂鲁米诺(>98% )购买自上海生物生工股份有限公司。氯金酸(HAuCl4.3H20)购买于萨恩化学技术(上海)有限公司(安耐吉)。无水乙醇(CH3CH2OH, AR)、水合肼(N2H4.H2O)和戊二醛(25% ,GA)购买自上海化学试剂品有限公司。牛血清白蛋白(BSA，纯度>99.8%，分子量68000)购买自厦门星隆达化学试剂有限公司。乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-轻基琥泊酰亚胺(NHS)购买自Sigma-Aldrich公司。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)和CEA抗体购买自上海领潮生物有限公司。实验所用水为去离子水(18.2M Ω )。二、AuiBSA纳米微球的制备 向50mL 5.0mg/mL的BSA溶液中加入20mL氯金酸溶液(28.43mM)，室温下剧烈搅拌lOmin。之后，在搅拌的条件下0.05mL N2H4.H2O,反应30min后，陈化12h。反应结束之后，产物在15000rpm离心15min，得到黑色固体。得到的固体，用蒸馏水和乙醇分别洗涤三次，冷冻干燥12h，待测。所制得的AuOBSA纳米微球的TEM如图1所示。三、Iuminol-Au本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纳米复合材料的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，该方法采用以下步骤：(1)在室温搅拌下，将HAuCl4溶液和牛血清白蛋白溶液混合均匀，在剧烈搅拌的条件下，向混合的溶液中快速加入水合肼，反应完全之后，陈化12小时，将得到的产物离心分离后，用蒸馏水和乙醇交替洗涤，最终将洗后的产物冷冻干燥制备得到的Au@BSA纳米材料；(2)利用戊二醛的交联作用，将发光物质鲁米诺化学交联到Au@BSA纳米材料表面，进一步活化Au@BSA表面的羧基以连接CEA抗体，制备得到复合材料luminol‑Au@BSA‑anti‑CEA；(3)利用电沉积的方法，在工作电极裸玻碳电极表面电沉积一层金纳米层，通过Au‑S键的作用将得到的复合材料luminol‑Au@BSA‑anti‑CEA连接到电极表面，得到对抗原CEA具有靶向作用的电化学发光免疫传感器。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贾能勤，章阿敏，黄楚森，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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