大鼠的遗传修饰制造技术

提供了用于制备包括大鼠胚胎干(ES)细胞的大鼠多能细胞和全能细胞的组合物和方法。提供了用于改善大鼠中遗传修饰的生殖系传递效率或频率的组合物和方法。此类方法和组合物包括了含饲养细胞层以及大鼠ES细胞群或大鼠ES细胞系的体外培养物，其中所述体外培养条件维持所述ES细胞的多能性并且包含了具有小鼠白血病抑制因子(LIF)或者其活性变体或片段的培养基。还提供了建立此类大鼠ES细胞系的各种方法。还提供了选择遗传修饰的大鼠ES细胞的方法，以及由本文所提供的遗传修饰的大鼠ES细胞产生转基因大鼠的各种方法。另外提供了各种试剂盒和制品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】大鼠的遗传修饰领域本专利技术提供非人类多能细胞、全能细胞及胚胎干(embryonicstem，ES)细胞，特别是大鼠多能细胞、全能细胞和/或大鼠ES细胞，以及其制备方法。提供了用于制备大鼠多能细胞、全能细胞及ES细胞的方法。提供了用于靶向大鼠多能细胞、全能细胞和/或ES细胞的方法。提供了用于在大鼠细胞中实现遗传修饰的生殖系传递的方法。提供了用于衍生化、生长并维持大鼠多能细胞、全能细胞及ES细胞的培养基。经EFS-WEB以文本文件形式提交的序列表的参考序列表的正式文本是依照美国信息交换用标准码(AmericanStandardCodeforInformationInterchange，ASCII)与说明书一起以文本文件形式经由EFS-Web提交，文件名称是441914seqlist.txt，于2014年2月20日创建并且大小是2Kb。经由EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分并且通过引用整体并入本文中。背景大鼠已经成为众多应用，包括但不限于，药物发现方面的应用的有价值的模型。由于难以获得遗传修饰的大鼠，确切地说，难以开发出用于对大鼠进行遗传修饰，并产生可以用于遗传修饰方案(包括但不限于，在大鼠基因组中引起遗传修饰的生殖系传递的方案)中的有用大鼠细胞的方法，故大鼠的有用性略有减少。本领域中需要可以被遗传修饰成能够通过生殖系传递该遗传修饰的大鼠细胞(例如胚胎干细胞)。本领域中需要改善在大鼠中进行遗传修饰的生殖系传递的频率。本领域中需要能够产生F0或全供体细胞来源的F0大鼠的来自各种大鼠品系的供体大鼠多能细胞、全能细胞和/或ES细胞。本领域中还需要能够产生包含生殖系遗传修饰的大鼠的供体大鼠多能细胞、全能细胞和/或ES细胞。专利技术概要提供了用于制备包括大鼠胚胎干(ES)细胞在内的大鼠多能和/或全能细胞的组合物和方法。提供了用于改善大鼠中遗传修饰的生殖系传递效率或频率的组合物和方法。在各种方面，这些方法和组合物包括了含饲养细胞层和大鼠ES细胞群或大鼠ES细胞系的体外培养物，其中体外培养条件允许维持所述大鼠ES细胞的多能性。还提供了建立大鼠ES细胞系的各种方法。还提供了选择遗传修饰的大鼠ES细胞的方法，而且本文中提供了由所述遗传修饰的大鼠ES细胞产生转基因大鼠的各种方法。另外提供了各种试剂盒和制品。非限制性实施方案如下：1.一种选自ACI或DA的品系的分离的大鼠ES细胞，其中所述分离的大鼠ES细胞能够通过生殖系传递其基因组。2.如实施方案1所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述细胞源自于ACI大鼠。3.如实施方案1或2所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述细胞源自于DarkAgouti(DA)大鼠.2。4.如实施方案1、2或3所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述细胞是整倍体并且能够通过所述生殖系传递靶向遗传修饰。5.如实施方案4所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞包含至少3％的所述靶向遗传修饰的生殖系传递效率。6.如实施方案4所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞具有至少60％的所述靶向遗传修饰的生殖系传递效率。7.如实施方案1-6中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞展现出至少2％的同源重组靶向效率。8.如实施方案1-8中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞能够在一轮连续电穿孔之后，将靶向遗传修饰传递到子代中。9.如实施方案1-8中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞包含一个或多个、两个或更多个，或者三个或更多个靶向遗传修饰。10.如实施方案4-9中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述靶向遗传修饰包括插入、缺失、敲除、敲入、点突变或其组合。11.如实施方案9所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述靶向遗传修饰包括所述细胞的基因组中异源多核苷酸的至少一处插入。12.如实施方案11所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述异源多核苷酸包含选择标记物。13.如实施方案12所述的分离的大鼠ES细胞，其中(a)所述选择标记物包含可操作地连接到启动子的不衰减的选择标记物基因；或(b)所述大鼠ES细胞包含编码所述选择标记物的多核苷酸的至少2个拷贝。14.如实施方案12所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述选择标记物相较于野生型选择标记物具有增加的活性。15.如实施方案1-14中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞当涂铺于包含LIF多肽、GSK3抑制剂和MEK抑制剂的培养物中的饲养细胞层上时，形成球状集落。16.如实施方案1-15中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞当在体外培养时，松散地粘附于所述饲养细胞层。17.如实施方案1-16中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述细胞不需要旁分泌LIF信号传导来维持多能性。18.如实施方案1-17中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述细胞是雄性(XY)大鼠ES细胞。19.如实施方案1-19中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述细胞是雌性(XX)大鼠ES细胞。20.如实施方案1-19中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞可以在包含GSK3抑制剂和MEK抑制剂的培养基中传代多达至少11次，而不降低其靶向遗传修饰的靶向效率或生殖系传递效率。21.如实施方案1-20中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞表达至少一种选自以下的多能标记物：Dnmt3L、Eras、Err-β、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1或其组合。22.如实施方案1-21中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞不表达选自c-Myc、Ecat1、Rexo1或其组合的一种或多种多能标记物。23.如实施方案1-22中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞不表达选自Brachyury、Bmpr2或其组合的一种或多种中胚层标记物。24.如实施方案1-23中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞不表达选自Gata6、Sox17、Sox7或其组合的一种或多种内胚层标记物。25.如实施方案1-24中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞不表达选自巢蛋白、Pax6或其组合的一种或多种神经标记物。26.如实施方案1-25中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述细胞表达包括Oct-4、Sox2、碱性磷酸酶或其组合的多能标记物。27.如实施方案1-26中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞以一个或多个大鼠ESC特异性基因的表达为特征，所述大鼠ESC特异性基因选自以下各物中的一种或多种：粘附连接相关蛋白(Ajap1)、紧密连接蛋白5(Cldn5)、Cdc42鸟嘌呤核苷酸交换因子9(Arhgef9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(Camk4)、肝配蛋白-A1(Efna1)、EPH受体A4(Epha4)、间隙连接蛋白β5(Gjb5)、胰岛素样生长因子结合蛋白样1(Igfbpl1)、白细胞介素36β(Il1f8)、白细胞介素28受体α(Il28ra)、左右决定因子1(Lefty1)、白血病抑制因子受体α(Lifr)、溶血磷脂酸受体2(Lpar2)、神经元正五聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选自ACI或DA的品系的分离的大鼠ES细胞，其中所述分离的大鼠ES细胞能够通过生殖系传递其基因组。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.02.20 US 61/767,0931.一种体外培养物，其包含：(a)饲养细胞层，所述饲养细胞层未被修饰成表达白血病抑制因子(LIF)；(b)培养基，所述培养基包含50U/mL至150U/mL的LIF及由MEK抑制剂和GSK3抑制剂组成的抑制剂组合，其中所述培养基不包含ESRF；以及(c)大鼠胚胎干(ES)细胞群，其中所述大鼠ES细胞：(i)被修饰以包含靶向遗传修饰，所述靶向遗传修饰包括所述大鼠ES细胞的基因组中异源多核苷酸的至少一个插入，并且能够通过生殖系传递所述靶向遗传修饰；(ii)缺乏c-Myc的表达；(iii)具有正常的核型；(iv)在培养物中形成球状、自由漂浮的集落。2.如权利要求1所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞源自于ACI大鼠或DarkAgouti(DA)大鼠。3.如权利要求1所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞能够在一轮或多轮电穿孔之后，将所述靶向遗传修饰传递到子代中。4.如权利要求2所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞能够在一轮或多轮电穿孔之后，将所述靶向遗传修饰传递到子代中。5.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述靶向遗传修饰包括缺失、敲除、敲入、点突变或其组合。6.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞包含两个或更多个靶向遗传修饰并且所述大鼠ES细胞能够通过生殖系传递所述两个或更多个靶向遗传修饰。7.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述异源多核苷酸包含选择标记,所述选择标记物具有一个或多个以下特征：(a)所述选择标记物包含可操作地连接到启动子的不衰减的选择标记物基因；(b)所述选择标记物相较于野生型选择标记物具有增加的活性；和(c)所述大鼠ES细胞包含稳定整合入基因组中的多个拷贝的所述选择标记物。8.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞是雄性(XY)大鼠ES细胞。9.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞是雌性(XX)大鼠ES细胞。10.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞可以在所述培养基中传代多达至少11次，而不降低所述靶向遗传修饰在所述大鼠ES细胞中的靶向效率或生殖系传递效率。11.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞具有一个或多个以下特征：(a)所述大鼠ES细胞表达至少一种选自以下的多能标记物：Dnmt3L、Eras、Err-β、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2及Utf1；(b)所述大鼠ES细胞不表达选自c-Myc、Ecat1及Rexo1的一种或多种多能标记物；(c)所述大鼠ES细胞不表达选自Brachyury及Bmpr2的一种或多种中胚层标记物；(d)所述大鼠ES细胞不表达选自Gata6、Sox17及Sox7的一种或多种内胚层标记物；(e)所述大鼠ES细胞不表达选自巢蛋白及Pax6的一种或多种神经标记物；(f)所述大鼠ES细胞表达选自Oct-4、Sox2及碱性磷酸酶的一种或多种多能标记物；和(g)所述大鼠ES细胞表达一个或多个选自下组的大鼠ESC特异性基因：粘附连接相关蛋白(Ajap1)、紧密连接蛋白5(Cldn5)、Cdc42鸟嘌呤核苷酸交换因子9(Arhgef9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(Camk4)、肝配蛋白-A1(Efna1)、EPH受体A4(Epha4)、间隙连接蛋白β5(Gjb5)、胰岛素样生长因子结合蛋白样1(Igfbpl1)、白细胞介素36β(Il1f8)、白细胞介素28受体α(Il28ra)、左右决定因子1(Lefty1)、白血病抑制因子受体α(Lifr)、溶血磷脂酸受体2(Lpar2)、神经元正五聚蛋白受体(Ntm)、非受体18型蛋白质酪氨酸磷酸酶(Ptpn18)、尾型同源框2(Cdx2)、III型纤连蛋白和锚蛋白重复结构域1(Fank1)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、淋巴样增强子结合因子1(Lef1)、Sal样蛋白3(果蝇)(Sall3)、SATB同源框1(Satb1)及miR-632。12.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中LIF的浓度是75U/mL至125U/mL。13.如权利要求12所述的体外培养物，其中LIF的浓度是90U/mL至110U/mL。14.如权利要求13中所述的体外培养物，其中LIF的浓度是100U/mL。15.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述LIF是小鼠LIF或包含与SEQIDNO:1的至少91％序列同一性。16.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述饲养细胞层包含有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)单层。17.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述MEK抑制剂包括PD0325901并且所述GSK-3抑制剂包括CHIR99021。18.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述MEK抑制剂是浓度为0.8μM至1.2μM的PD0325901并且所述GSK-3抑制剂是浓度为2.5μM至3.5μM的CHIR99021。19.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述培养基中的LIF浓度为100U/mL，MEK抑制剂是浓度为1μM的PD0325901，且所述GSK-3抑制剂是浓度为3μM的CHIR99021。20.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述培养基包括以下成分：浓度为1x的DMEM/F12基础培养基；浓度为1x的Neurobasal培养基；浓度为1％的青霉素/链霉素；浓度为4mM的L-谷氨酰胺；浓度为0.1mM的2-巯基乙醇；浓度为1x的N2补充物；浓度为1x的B27补充物；浓度为100U/ml的LIF；浓度为1μM的PD0325901；以及浓度为3μM的CHIR99021。21.如权利要求1-4中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞源自于大鼠囊胚期胚胎或大鼠桑椹胚期胚胎。22.如权利要求21所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞群包含未分化的无定形大鼠ES细胞团的分离的生长晕。23.一种用于产生大鼠胚胎干(ES)细胞系的方法，所述方法包括：(a)在体外培养第一层饲养细胞和桑椹胚期或囊胚期大鼠胚胎，所述第一层饲养细胞未被遗传修饰成表达白血病抑制因子(LIF)，其中所述桑椹胚期或囊胚期大鼠胚胎的透明带已经被去除，并且其中培养条件维持大鼠ES细胞的多能性并且包含培养基，所述培养基包含50U/mL至150U/mL的LIF和由MEK抑制剂和GSK3抑制剂组成的抑制剂组合，其中所述培养基不包含ESRF；及(b)将未分化的无定形大鼠ES细胞团的生长晕转移到包含第二层饲养细胞的体外培养物孔中，其中所述第二层饲养细胞未被遗传修饰成表达LIF；及(c)在包含具有50U/mL至150U/mL的LIF及由MEK抑制剂和GSK3抑制剂组成的抑制剂组合的培养基的条件下培养所述生长晕，其中所述培养基不包含ESRF，并由此维持所述大鼠ES细胞的多能性；(d)修饰大鼠ES细胞以使其包含靶向遗传修饰，所述靶向遗传修饰包括所述大鼠ES细胞的基因组中异源多核苷酸的至少一个插入，并且所述大鼠ES细胞：(i)能够通过生殖系传递所述靶向遗传修饰；(ii)缺乏c-Myc的表达；(iii)具有正常的核型；(iv)在培养物中形成球状、自由漂浮的集落。24.如权利要求23所述的方法，进一步包括：(e)将至少一种来源于步骤(d)的经修饰的所述大鼠ES细胞引入大鼠宿主胚胎中以产生F0胚胎；(f)将所述F0胚胎植入代孕母体中；(g)使所述F0胚胎在所述代孕母体中孕育到足月；及(h)鉴别出具有所述靶向遗传修饰的F0大鼠。25.如权利要求24所述的方法，其中所述遗传修饰的大鼠ES细胞来自与所述大鼠宿主胚胎相同的大鼠品系。26.如权利要求24所述的方法，其中所述遗传修饰的大鼠ES细胞来自与所述大鼠宿主胚胎不同的大鼠品系。27.一种产生遗传修饰的大鼠的方法，所述方法包括：(a)提供包含大鼠ES细胞群的大鼠ES细胞系，所述大鼠ES细胞群通过用培养基在饲养细胞层上培养分离的大鼠ES细胞而获得，所述饲养细胞层未被遗传修饰成表达LIF，所述培养基包含50U/mL至150U/mL的LIF及由MEK抑制剂PD0325901和GSK3抑制剂CHIR99021组成的抑制剂组合，其中所述培养基不包含ESRF，以及其中所述大鼠ES细胞群缺乏c-Myc的表达；在培养物中形成球状、自由漂浮的集落；是二倍体；以及具有生殖能力；(b)获得包含靶向遗传修饰的大鼠ES细胞集落，其中所述获得包括：(i)修饰所述大鼠ES细胞群，使得所述大鼠ES细胞群包含所述靶向遗传修饰；以及(ii)在单个克隆步骤中鉴别出具有所述靶向遗传修饰的大鼠ES细胞集落；(c)向大鼠宿主胚胎引入所述大鼠ES细胞集...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·D·李，W·奥尔巴克，D·赫斯林，D·弗伦德维，K·V·莱，D·M·瓦伦泽拉，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US