本发明专利技术公开了一种利用生物转化法制备γ‑氨基丁酸的方法，属于γ‑氨基丁酸制备技术领域。以短乳杆菌CGMCC NO.3414为出发菌株，经增殖培养和菌体收集，将菌体重悬于科学复配L‑谷氨酸钠、谷氨酸混合物的缓冲溶液中，加入对菌株所产胞内酶具有较强激活作用的Na2B4O7·10H2O或MgSO4，以最大限度地发挥胞内酶的活性，将L‑谷氨酸钠、谷氨酸混合物催化转化为γ‑氨基丁酸，转化液中γ‑氨基丁酸含量为45.74‑202.18g/L,底物摩尔转化率为95.92‑99.75％，菌体可重复利用8次。该方法不仅提高了产品质量和产量，而且保护了环境，具有较好的经济价值和社会效益，可规模化生产，利于工业推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及y-氨基丁酸的制备，具体涉及一种利用生物转化法制备y-氨基丁 酸的方法。
技术介绍
y_氨基丁酸（y-aminobutyricacid，GABA)是一种广泛存在于动植物体中的天 然非蛋白质氨基酸。在哺乳动物体内，Y-氨基丁酸作为脑和脊髓中的重要抑制性神经递 质，由谷氨酸（Glutamicacid，Glu)在谷氨酸脱駿酶（Glutamatedecarboxylase，GAD，EC 4.I.I. 15)的作用下催化脱羧转化而来，并参与多种代谢活动，具有很高的生理活性，具有 降血压、调节心律失常、改善睡眠、抗焦虑、改善脂质代谢、防止动脉硬化等功效，因此受到 越来越多的科学工作者的关注。在日本，这类富含GABA的功能性食品的研究取得了较大的 进展。大久长范、津志田藤二郎等人分别利用富集技术以糙米、米胚芽、茶叶、大豆等为食品 原料成功研制出了GABA大米、GABA茶等产品。2009年，GABA被我国当时的卫生部列为新 资源食品（现更名为新食品原料）。 GABA的制备方法主要有化学合成法和微生物发酵法。常见的化学合成法是将邻苯 二甲酰亚胺钾和4-氯丁氰进行反应，产物经过浓硫酸回流水解后结晶提纯得到，其反应如 下： 此外还有以吡咯烷酮作为原料，经过氢氧化钙和碳酸氢铵水解开环制得GABA，反 应如下： 虽然通过化学合成方法来制备GABA具有反应速度快的优势，但由于其合成成本 较高，而产率较低，并且在其生产工艺中使用了危险溶剂、甚至有毒溶剂，因而化学合成法 制备的GABA不能用于食品，也不能被认为是天然的食品添加剂。 微生物发酵法主要是通过具有高活性GAD的微生物发酵生产GABA。发酵法具有生 产条件温和、易放大、生产成本相对较低等优点。中国专利CN102174449B公开了一种高产 T_氨基丁酸的生产方法及应用，包括菌种分离筛选、叮啶橙一紫外线诱变和N+注入诱变 获得一株高产T-氨基丁酸（Lactobacillusbrevis)TCCC(CGMCCNO. 3414)菌株；发酵培 养基和发酵条件的优化以及采用该菌株的生长细胞发酵和休止细胞的生物转化相偶联生 产T-氨基丁酸；采用膜过滤、吸附树脂脱色、强酸阳离子树脂离交、乙醇重结晶等技术以 及制备色谱技术节能降耗技术，将Y-氨基丁酸从发酵和生物转化液中分离出来，提纯制 得纯度达99%的结晶y-氨基丁酸。中国专利CN102559552A公开了一种高产y-氨基 丁酸的生产方法及应用，其中的高产y-氨基丁酸（GABA)生长棉子糖肠球菌M1，保藏号为 CGMCCNo. 5584。其生产方法包括菌种分离筛选获得一株高产y-氨基丁酸的（Entercoccus raffinosus)TCCC11660(CGMCCNo. 5584)菌株、发酵培养基和发酵条件的优化以及IOL发 酵罐实验。中国专利CN104388514A公开了利用一种复合菌种发酵制备y-氨基丁酸的 方法，发酵菌株包括植物乳杆菌ZSM-002、卡斯特酒香酵母ZSM-OOl和保藏号为CCTCCNO: M2014376的根霉（Rhizopusoryzae)zsm_005,其特征在于，以谷物种子或含胚副产物为 原料，经清洗消毒、Y-氨基丁酸富集、分离提取、精制与纯化等过程制备高浓度液态Y-氨 基丁酸产品，液态T-氨基丁酸经干燥过程制备高浓度固态T-氨基丁酸产品。中国专利 CN103555779B公开了利用一种发酵生产y-氨基丁酸的方法，是将两种谷氨酸脱羧酶基 因gadBl，gadB2构建共表达载体导入到谷氨酸生产菌中构建基因工程菌，利用基因工程菌 表达的谷氨酸脱羧酶将其自身积累的谷氨酸脱去一个羧基合成出Y-氨基丁酸的复合菌 种发酵制备Y-氨基丁酸的方法。通过对种子培养基、发酵培养基和发酵条件优化，尤其是 尿素在6-24小时内间断补加，大大提高了GABA的产量和谷氨酸转化率。上述已经公开的 专利无论是经分离、诱变得到的纯化菌株还是经改造的工程菌株；无论是单一菌种发酵还 是混合菌种发酵，其发酵法生产Y-氨基丁酸的方法仍然存在以下几个方面的问题：（1)发 酵周期长，一般需要几十到上百小时；（2)发酵过程放热量大，冷却循环水用量大，能耗高； (3)发酵液组成比较复杂，提取成本较高；(4)废渣产量相对较大，菌体过滤困难，活性炭、 珍珠岩等物质用量大，副产物给企业带来处理压力。 而采用微生物转化法生产GABA可以提高底物转化率和产品纯度，具有节约生产 成本、缩短生产周期及降低环境污染等诸多优点。中国专利CN104031951A公开了一种利 用乳酸菌静息细胞发酵生产T-氨基丁酸工艺，利用经过诱导的乳酸菌活性静息细胞体， 分散于含有底物的转化缓冲液中，在合适的条件下转化生产Y-氨基丁酸；利用该方法可 以大幅度缩短转化时间，提高转化效率，产物成份简单，利于分离提纯，且转化无需无菌条 件，设备要求简单，耗能低；经条件优化，本工艺已适合工业化生产。中国专利CN103320362 A-株产谷氨酸脱羧酶的菌株及用其生产Y_氨基丁酸的方法，提供了一株从泡菜中筛选 而来的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)SK30. 001，已保藏于中国典型培养物保藏 中心，保藏编号为CCTCCN0:M2013250,并提供了一种利用该菌株发酵生产y-氨基丁酸的 方法，该方法包括：(a)在发酵培养基中对该菌株进行培养，以得到该植物乳杆菌菌体；(b) 用植物乳杆菌菌体转化谷氨酸钠生成T-氨基丁酸；（c)y-氨基丁酸的分离纯化。上述公 开的专利仍然存在Y-氨基丁酸产量低、转化时间长、转化率低等缺陷，效果不太理想。 因此，探索一种Y-氨基丁酸产量高、转化时间短、转化率高的直接利用高产菌株 菌体转化MSG制备GABA的方法仍是本领域技术人员的不懈追求。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是克服现有直接利用高产菌株菌体转化制备y-氨基 丁酸的方法的缺陷，以具有高效转化L-谷氨酸钠（MSG)或谷氨酸（GLu)为y-氨基丁酸 (GABA)能力的短乳杆菌（Lactobacillusbrevis)CGMCCNO. 3414为出发菌株，经增殖培养 和湿菌体收集，将湿菌体重悬于科学复配L-谷氨酸钠（MSG)、谷氨酸（GLu)混合物的缓冲溶 液中，加入对菌株所产胞内酶具有较强激活作用的Na2B4O7 ?IOH2O或MgSO4，以最大限度地发 挥胞内酶的活性，将L-谷氨酸钠（MSG)、谷氨酸（GLu)混合物催化、转化为y-氨基丁酸，再 加上与缓冲溶液中其它成分的科学复配、协同作用，大大提高了L-谷氨酸钠（MSG)和谷氨 酸（GLu)的摩尔转化率和y-氨基丁酸的产量。 为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案： -种利用生物转化法制备y-氨基丁酸的方法，包括如下步骤： 1)将保存完好的短乳杆菌CGMCCNO. 3414的斜面菌种活化1-3次，接种1-2环于 种子培养基中，30_35°C静置培养12h后，以5-20% (V/V)的接种量接种到发酵培养基中， 30-35°C静置培养16-72h得发酵液； 进一步地，所述种子培养基组成为：玉米糖化液15-30g，蛋白胨5-15g，酵母浸出 粉5-10g，柠檬酸铵l-5g，硫酸镁0. 3-1. 0g，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用生物转化法制备γ‑氨基丁酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：将保存完好的短乳杆菌CGMCC NO.3414的斜面菌种活化后，逐级扩培至种子培养基、发酵培养基，于30‑35℃静置培养16‑72h，离心、洗涤，收集湿菌体；向每升缓冲溶液中加入收集得到的湿菌体25‑75g、底物70‑320g、磷酸吡哆醛0.05‑0.3mmol、Na2B4O7·10H2O或MgSO40.14‑0.72g、表面活性剂0.5‑2g，均匀混合，于温度25‑55℃、转速150‑200r/min催化转化4‑12h得到转化液，转化液经常规分离、提取和纯化工艺即得纯化γ‑氨基丁酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高强，高年发，石秀峰，常传友，朱燕，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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