一种细胞膜定位信号肽及其编码序列和应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体地涉及一种细胞膜定位信号肽及其编码序列和应用。信号肽为(a)或(b)；(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有细胞膜定位信号肽功能的衍生多肽。本发明专利技术提供的信号肽可以将目标蛋白靶向定位于宿主细胞膜上。本发明专利技术提供的细胞膜定位信号肽与合适的目标蛋白形成融合蛋白，可用于开发治疗病毒、寄生虫、细菌感染的疫苗和药物，并实现高效给药。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，具体地涉及一种细胞膜定位信号肽及其编码序列 和应用。
技术介绍
生活在不同环境的细菌通过分泌具有多种生物学功能的蛋白到细胞表面或细胞 外来应对环境的变化，以维持自身在环境的生存和繁殖。病原菌有多种蛋白分泌系统，在不 同的环境条件下，它们会利用不同的蛋白分泌系统与宿主发生相互作用，将活性蛋白分泌 到宿主组织或细胞内，发挥不同的生理功能。革兰氏阴性菌有六种蛋白分泌系统（I-VI)， 不同的病原菌具有不同的蛋白分泌系统，不同的蛋白分泌系统具有不同的分泌机制。按照 底物蛋白的分泌路径，I、II、V型分泌系统将蛋白分泌到细菌细胞周围但不直接进入宿主细 胞，III、IV、VI型分泌系统将蛋白直接输送到宿主细胞内。按照底物蛋白分泌是否依赖信 号肽，将细菌的蛋白分泌系统分为Sec依赖型分泌系统和Sec不依赖性分泌系统，II、IV为 Sec(Signalsequences)依赖型分泌系统，I、III型为Sec不依赖型分泌系统。研究人员根 据细菌的不同蛋白分泌系统转运蛋白的特性，研究出定向转运蛋白的细菌载体用于构建重 组疫苗或抗肿瘤疫苗，用于预防疾病。例如，将沙门氏菌II型分泌系统底物蛋白的信号肽 与肺炎链球菌蛋白PspA建立融合表达载体，在减毒沙门氏菌疫苗表达融合蛋白构建二价 疫苗，可以同时预防沙门氏菌病和肺炎球菌病；而利用沙门氏菌的I或V型蛋白分泌系统， 将肿瘤抗原或细胞因子呈递到宿主免疫细胞内，可以研制抗肿瘤疫苗。 细菌III型分泌系统（T3SS)由一组蛋白组成跨膜蛋白转运系统，将细菌产生的 蛋白从细菌的细胞质直接转运到宿主细胞。针对T3SS将蛋白转运到宿主细胞内的机制， 研究人员开展了相关研究，利用T3SS将异源抗原转运到动物体内，用以治疗病毒、胞内寄 生菌、寄生虫引起的疾病，也用于呈递细胞因子治疗结肠癌、黑色素细胞瘤、乳腺癌等。要实 现T3SS输送目的蛋白，需要明确T3SS转运的底物蛋白的信号肽序列，借助信号肽将目的蛋 白定位到宿主细胞内。根据目前的研究进展，通过T3SS途径分泌的底物蛋白没有典型的 Sec依赖信号序列，其分泌信号肽可能位于底物蛋白的不同位置，也可能是编码底物蛋白的 5'mRNA。因此鉴定T3SS底物蛋白的转运信号肽是研制靶向疫苗和药物的关键。 海水鱼类养殖在我国发展迅速，是我国水产养殖的重要组成部分，由于养殖规模 扩大、养殖环境恶化以及种质退化等原因，由细菌、病毒、寄生虫引起的病害已严重影响鱼 类养殖业的发展，依靠抗生素、消毒剂的病害防治方法容易造成抗生素在水产品的残留以 及环境微生物的耐药性，影响食品安全和水产养殖业的可持续发展。依靠疫苗防控病害的 方法可以减少抗生素等化学药剂的使用，受到国际上的广泛认可和普遍推广。我国研究人 员研制的多种灭活疫苗和基因工程疫苗都具有良好的免疫保护效果。但是，目前的疫苗存 在如下问题：一是多为激发体液免疫的疫苗，这些疫苗难以治疗寄生于细胞内的病毒、寄生 虫、细菌引起的疾病；二是现有的疫苗多为单联或单价疫苗，而我国鱼类养殖病原种类多， 针对一种病原引起疾病的单联或单价疫苗已经难以满足养殖发展的需要。鉴于这些情况， 开发定向呈递的多联/多价疫苗是解决上述问题的一个途径。 迟缓爱德华氏菌（Edwardsiellatarda)是鱼类的重要病原菌之一，为胞内寄生 菌，可侵入鱼上皮细胞和吞噬细胞，并在细胞内生长和繁殖，最终导致鱼类出血性败血症。 该菌有多种致病因子，其中T3SS是其中一个重要的致病因子，具有协助细菌寄生于宿主细 胞内、抗吞噬细胞免疫杀伤等功能。迟缓爱德华氏菌的T3SS由35个基因组成，分别编码 装置蛋白、效应蛋白、分子伴侣和调节蛋白，目前已知有四个底物蛋白（EseG、FliC、EseJ和 0rfl3)通过迟缓爱德华氏菌的T3SS转运到宿主细胞细胞内，为本专利技术鉴定迟缓爱德华氏 菌T3SS底物蛋白转运信号肽奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为： -种细胞膜定位信号肽，信号肽为（a)或（b); (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽； (b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有细胞膜定位信号肽功能的衍生多肽。 -种细胞膜定位信号肽的基因，细胞膜定位信号肽的基因为1)一3)中任一所述 的DNA分子： 1)序列表中序列1所示的DNA分子； 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有细胞膜定位信号肽功能蛋 白的DNA分子； 3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有细胞膜定位信号肽功能 蛋白的DNA分子。 含所述DNA分子的重组表达载体、表达盒、重组菌或转基因细胞系。 所述DNA分子序列插入质粒pCX340的多克隆位点得到的重组质粒。 -种细胞膜定位信号肽在将目标蛋白定位于细胞膜的应用。 所述目标蛋白具体为P-内酰胺酶蛋白（TEMl)。 将本专利技术提供的细胞膜定位信号肽与合适的目标蛋白形成融合蛋白，可用于开发 治疗病毒、寄生虫、细菌感染的疫苗和药物，并实现高效给药。 -种将目标蛋白定位于细胞内的方法，采用序列表中序列2所示多肽或其衍生肽 作为细胞膜定位信号肽将目标蛋白定位于细胞膜上。 所述细胞具体为HeLa细胞或牙鲆肾细胞。所述方法为：将融合基因导入迟缓爱德 华菌LSE40,感染细胞并表达，从而将目标蛋白定位于所述细胞的细胞膜上；所述融合基因 自上游至下游依次包括编码多肽的DNA分子序列和编码P-内酰胺酶蛋白的基因序列。 本专利技术所具有优点： 本专利技术提供的细胞膜定位信号肽可将目标蛋白靶向定位于细胞膜。将本专利技术提供 的细胞膜定位信号肽与合适的目标蛋白形成融合蛋白，其中，利用迟缓爱德华氏菌的T3SS 途径，构建定向转运靶蛋白的载体系统，旨在将外源蛋白呈递到宿主细胞内，为研制以迟缓 爱德华氏菌为载体的高效多价疫苗提供工具，可用于开发治疗病毒、寄生虫、细菌感染的疫 苗和药物，并实现高效给药。【附图说明】图1为本专利技术的重组质粒pCX108的载体图谱；其是将序列表的序列1选用NdeI 和EcoRI酶切位点与pCX341质粒连接得到的产物。 图2为重组质粒pCX108构建的验证结果图；其是将质粒pCX108用NdeI和EcoR I进行双酶切后，得到PCX341质粒和324bp的插入DNA片段。泳道1，2为重组质粒。 图3为质粒pCX341和重组质粒pCX108在迟缓爱德华菌LSE40表达融合蛋白的检 测图；其是将PCX341和pCX108分别转入迟缓爱德华菌LSE40,得到重组菌LSE40pCX341和 LSE40pCX108,在DMEM培养后，提取LSE40pCX341和LSE40pCX108培养物的上清胞外蛋白 (ECP)和细胞总蛋白（TCP)，用westernblot检测融合蛋白的表达情况。用细菌细胞质蛋 白DnaK作为质控蛋白，用以检测ECP组分是否被TCP组分污染。 图4为重组菌LSE40pCX341和LSE40pCX108侵染HeLa细胞后表达融合蛋白的检 测图；其是将重组菌LSE40pCX341和LSE40pCX108侵染HeLa细胞，提取HeLa细胞蛋白，用 westernblot检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞膜定位信号肽，其特征在于：信号肽为(a)或(b)；(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有细胞膜定位信号肽功能的衍生多肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：莫照兰，李贵阳，李杰，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37