一种靶向沉寂CDK2基因的重组腺相关病毒制造技术

本发明专利技术涉及一种靶向沉寂CDK2基因的重组腺相关病毒。实验证明，该重组腺相关病毒rAAV-shRNA-CDK2可以在体内长期稳定表达，从而起到沉寂CDK2基因表达、抑制肝癌细胞生长的作用，且毒副作用小。建立了一种有效治疗肝癌的手段和方法，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学与生物医药
，具体涉及一种靶向沉寂⑶K2基因 的重组腺相关病毒。 技术背景 肝癌由于发病率高、治疗困难、死亡率高等特点在我国恶性肿瘤疾病中居第二位 死因，每年死于肝癌的人数占全世界肝癌年死亡总数的53 %，其发病机制至今仍不明了，治 疗方法主要包括放化疗、手术及肝移植，然而，80%以上的肝癌患者病情已到晚期，无法应 用上述治疗方法，即使能够实施手术切除，术后的复发率也比较高，而且术后的长期预后不 能令人满意，因此尚需尽快找到有效的早期诊断方法和治疗靶点。 研究发现细胞的失控性增殖是恶性肿瘤细胞侵袭性生长及转移的最基本特征，而 其根本原因就是细胞周期调控机制的破坏，已发现的与细胞周期调控密切相关的分子主要 有细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependentkinase，Q)Ks)、细胞周期蛋白（Cyclin) 以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclin-dependentkinaseinhibitor，CKI)三大 类。CDK2是细胞周期过程关键的限速因子，在整个细胞周期中表达水平保持不变，如果单 独存在是没有活性的，只有在不同的细胞周期进程中，与相应的Cyclin结合后才会呈现出 蛋白激酶的活性，磷酸化不同的底物，从而启动或调控细胞周期的主要事件，驱动细胞周期 进程。在细胞周期中主要有两个检查点：G1/S期和G2/M期，这些检查点对细胞周期起着 监控作用，其中，G1/S检查点是细胞周期中的主要限制点（restrictionpoint)，而CDK2/ CyclinE复合物在此过程中起关键性作用。CyclinE是⑶K2的调节亚基，调节着⑶K2的 活性，当细胞由Gl期进入S期，首先⑶K2会与CyclinE结合成复合物，激活⑶K2,使视 网膜母细胞瘤基因（retinoblastoma，Rb)磷酸化，高磷酸化后的Rb会完全释放出游离的 转录因子E2F，启动DNA的合成，加速细胞从Gl期进入S期。当细胞进入S期后，⑶K2/ CyclinE复合体降解，⑶K2转而与CyclinA结合成新的复合体，从而推进细胞周期由S期 越过限制点进入G2期；因此CDK2活性增高，可以促进细胞的增殖和分化，是细胞周期的正 调节因子，可通过抑制相应的CDK或CDK/Cyclin复合物的活性，阻止细胞周期进程（详见 文南犬：KusumotoK.Structuralfeaturesofglutamate-basedlipidicmaterials forsmallinterferingRNAdeliverysystem.JBiomedMaterResA,2009,89(3)： 739-750 ； YangX，ZuX，TangJ，etal.Zbtb7suppressestheexpressionofCDK2 andE2F4inlivercancercellsimplicationsfortheroleofZbtb7incellcycle regulation.MolMedReport，2012,5 (6) :1475_1480)〇 大量研究表明肿瘤的发生与CDK2和其它细胞周期相关因子的异常表达有关， CDK2基因表达异常，会引起细胞周期紊乱、细胞增殖失控，最终导致癌症。张桂东等研究证 实，CDK2蛋白的异常表达会引起早期胃癌的发生，为临床上胃癌早期诊断提供实验依据。 此外还发现肺癌、结直肠癌、鼻咽癌等肿瘤细胞中CDK2都呈高表达状态。新近研究发现， 靶向⑶K2的shRNA能够抑制肝癌细胞的增殖，因此，通过⑶K2基因的深入研究，不仅有助 于揭示肿瘤的发生机理，还能为肿瘤的预防和治疗提供新的思路和手段，由此将CDK2作为 肿瘤治疗祀点是一种可行的方法（详见文献：KusumotoK.Structuralfeaturesof glutamate-basedlipidicmaterialsforsmallinterferingRNAdeliverysystem. JBiomedMaterResA,2009,89(3) :739-750 ； YangX,ZuX,TangJ,etal.Zbtb7 suppressestheexpressionofCDK2andE2F4inlivercancercellsimplications fortheroleofZbtb7incellcycleregulation.MolMedReport，2012,5(6)： 1475-1480 ； GaoJJ，FengXB，YoshinoriI，etal.Des-y-carboxyprothrombinand c-Metwereconcurrentlyandextensivelyexpressedinhepatocellularcarcinoma andassociatedwithtumorrecurrence.BiosciTrends，2012,6 (4) :153-159; JangKY，NohSJ，LehwaldN，etal.SIRTlandc_Mycpromotelivertumorcell survivalandpredictpoorsurvivalofhumanhepatocellularcarcinomas.PLOS 0ne，2012,7(9) :e45119)。 基因治疗是通过一定的载体，将外源基因导入靶细胞，并可有效的进行表达，达到 治疗疾病的目的。腺相关病毒（AAV)因其可以长期稳定表达目的蛋白以及高度的安全性得 到了越来越多的关注。作为基因治疗载体AAV有如下优点=(I)AAV感染范围比较广，能感 染分裂期细胞和非分裂期细胞；（2)AAV引起的免疫反应低，致病性低；(3)定点整合，避免 了随机整合导致的宿主细胞发生突变的危险性；(4)携带的外源基因可持续稳定表达；（5) AAV理化性质稳定，抗酸碱性和热稳定性好，便于保存。基于这些特性，使AAV成为基因转移 最为理想的载体之一。 8型腺相关病毒（AAV8)属于"杂合"载体，将AAV8的cap基因与携带r印基因、 ITR结构的AAV2组合可得到重组AAV2/8,简称rAAV8。AAV8对肝脏的转染效率较其它血 清型高出10~100倍，因其在肝脏组织显示了高效稳定的基因转染而备受关注。重组 AAV8(rAAV8)现已广泛应用于肿瘤、遗传性疾病、自身免疫性疾病以及抗病毒的基因治疗 研究中。Nakai等研究发现通过小鼠尾静脉注射给药，rAAV8在体内的转染率及表达水平 和给药量成线性关系，转染效果可以达到100%，并且可持续至少1年以上的时间（详见 文南犬：NakaiH，FuessS，StormTA，etal.Unrestrictedhepatocytetransduction withadeno-associatedvirusserotype8vectorsinmice.JVirol，2005,79(I)： 214-224 ； SarkarR，TetreaultR，GaoG，etal.Totalcorrectionofhemophilia AmicewithcanineFVIIIusinganAAV8serotype.Blood,2004,103本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向沉寂CDK2基因的重组腺相关病毒，其特征在于，所述的重组腺相关病毒是由下列方法构建得到的：a根据人肝癌细胞CDK2基因序列，设计针对CDK2特异性的siRNA序列，构建重组质粒pAKD‑shRNA‑CDK2，利用菌落PCR技术进行DNA测序分析；b将重组质粒pAKD‑shRNA‑CDK2、包装质粒pAAV‑RC和辅助质粒pHelper用磷酸钙法共转染AAV‑293细胞，收获重组腺相关病毒rAAV‑shRNA‑CDK2，采用定量PCR方法对病毒进行滴度测定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于英君，于水澜，李和伟，姜颖，张梅，宋高臣，刘厚广，韩晶晶，肖景仁，韩松阳，
申请(专利权)人：于英君，于水澜，李和伟，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23