本发明专利技术公开了一种甜瓜叶片蔗糖磷酸合成酶的提取及活性测定方法，包括以下步骤：(1)酶液提取：取新鲜的甜瓜叶片迅速置于研钵中,用冰浴过的提取缓冲液研磨，充分匀浆后高速冷冻离心，取上清液用离心式去盐柱脱盐,提取的酶液可直接用于酶活性测定；(2)酶活性测定：取上述酶液加入反应底物，给予不同的反应温度及反应时间，确定甜瓜叶片蔗糖磷酸合成酶最佳反应温度及反应时间，从而能更精确的反映酶的活性。本发明专利技术能够有效将初提取酶液中的盐分、糖分、离子等小分子物质除去，并优化了酶的反应条件，从而能够更精确地测定叶片中蔗糖磷酸合成酶的活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种从甜瓜叶片提取蔗糖磷酸合成酶以及测定其活性的方法。
技术介绍
蔗糖磷酸合成酶是一种关键的蔗糖代谢酶，也是一种重要的光合酶，其活性与净 光合速率呈正相关，因此研究该酶活性对于改善甜瓜光合作用具有重要意义。目前蔗糖磷 酸合成酶提取大部分采用的是G-25 Sephadex柱和透析袋，G-25 Sephadex柱价格昂贵，提 取成本较高，而透析袋价格较低，但操作繁杂，耗费时间，且提取效率低；离心式去盐柱价格 稍高，但具有可再生性，提取效率优于透析袋和G-25 Sephadex柱。在酶活性测定方面，目 前存在的问题是酶与底物反应时间及温度研究者较少关注，不同的材料其最佳反应条件不 一，本专利技术优化了甜瓜叶片蔗糖磷酸合成酶活性测定条件。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种甜瓜叶片蔗糖磷酸合成酶的提取及活性测 定方法。 为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：甜瓜叶片蔗糖磷酸合成酶的 提取及活性测定方法，包括以下步骤： (1)酶液提取：称取2g甜瓜新鲜叶片，放入预冷的研钵中，加IOmL提取缓冲液；加 入石英砂，冰浴下研磨，充分匀浆后，0~4°C条件下12000rpm离心20min，取上清液，去除初 提酶液中的盐分，纯化后的酶液可直接用于酶活性测定； (2)酶活性测定：以0. 2mL酶液沸水浴IOmin为对照；取0. 2mL酶液加入反应 底物；15~40°C条件下反应3~30min;沸水浴lmin，用双蒸水定容至lmL，加入0.ImL 2mol?L1NaOH,沸水浴lOmin，流水冲洗冷却；向反应液中加入3. 5mL30%HC1，ImL0. 1% 间苯二酸，摇勾后在80°C水浴锅中水浴lOmin，流水冷却后，480nm比色。 作为优选，步骤（1)中，提取缓冲液由以下组分组成：50mmol?L1HEPEStN-Q-羟 乙基）哌嗪-N' -2 横酸]，Immol?L1EDTA.Na2，IOmmol?L1MgCl2, 2. 5mmol?L1DTT, IOmmol?L1抗坏血酸；且HEPES提取缓冲液的pH值为7. 5。 作为优选，步骤（1)中采用离心式去盐柱去除初提酶液中的盐分。 作为优选，步骤（2)中，反应底物包含0.ImL50mmol?L-1果糖-6-磷酸，0.ImL 3Ommol?L1UDPG, 0.ImL10OmnioI?L1Tris, 0. 05mL10mmol?L1MgCl20 作为优选，步骤（2)中，甜瓜叶片蔗糖磷酸合成酶及反应底物在30°C水浴中反应 5min即可达到最高酶活性。 本专利技术的有益效果是： 能够有效将初提取酶液中的盐分、糖分、离子等小分子物质除去，从而更能够精确 地测定叶片中鹿糖磷酸合成酶的活性。【具体实施方式】( -）实验方法 1、供试材料：安徽省农业科学院园艺研究所自主选育的甜瓜品种"早甜一号"，搜 集到的甜瓜变种"羊角蜜"、"S1"。 2、实验设计 甜瓜长至三叶一心时取同一部位叶片，将叶片剪碎混匀，每份称取2g，迅速置于液 氮中速冻，然后保存在-80°C冰箱中备用。本试验分别采用离心式去盐柱、G-25Sephadex 柱和透析袋提取蔗糖磷酸合成酶。每个处理3次重复。 3、蔗糖磷酸合成酶的提取 将待测样品放入预冷的研钵中，加IOmL提取缓冲液（50mmol*L1HEPES,lmmol*L1E DTA.Na2,IOmmol?L1MgCl2, 2. 5mmol?L1DTT,IOmmol?L1抗坏血酸，pH7. 5);加入石英砂， 冰浴下研磨，充分勾衆后，0~4°C条件下12000rpm离心20min，取上清液，取0. 5mL上清液 慢慢滴入离心式去盐柱（Spin-OUT?GT-1200)，收集到的酶液可直接用于酶活性测定。 4、蔗糖磷酸合成酶活性的测定 在 0? 35mL反应液中（0?ImL50mmol?L1果糖-6-磷酸，0?ImL30mmol?L1UDPG, 0.ImL100mmo1?L1Tris, 0. 05mL10mmol.L1MgCl2)加入 0? 2mL酶液，30°C条件下反应 5min 后，沸水浴lmin，用双蒸水定容至lmL，加入0.ImL2mol?L1NaOH,沸水浴lOmin，流水冲洗 冷却；向反应液中加入3. 5mL30%HCl，ImL0. 1 %间苯二酸，摇匀后在80°C水浴锅中水浴 lOmin，流水冷却后，480nm比色。 (二）结果分析 1、不同处理方法提取甜瓜叶片蔗糖磷酸合成酶活性比色值比较表1由表1可知，甜瓜叶片采用不同的方法提取蔗糖磷酸合成酶，其提取效率差异较 大，离心式去盐柱提取的酶液其比色值远远高于G-25Sephadex柱和透析袋，透析袋提取效 率最低。 2、标准曲线制作方法 (1)将分析纯蔗糖在80°C下烘至恒重，精确称取蔗糖lg，加水溶解，定容到50mL， 即鹿糖的标准液（200yg?mL3。 (2)取7个试管编号，按照表2所示的量精确配制溶液 表2标准曲线配制比较 各管溶液混匀后，沸水浴lOmin，流水冲洗冷却；向反应液中加入3. 5mL30%HC1， ImL0. 1 %间苯二酸，摇勾后在80°C水浴锅中水浴lOmin，流水冷却后，480nm比色。 以含糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并求出标准曲线方程（y =433. 5Xx+7. 999,R2= 0? 998)。 3、酶活性计算 酶活性（ymol?h1?g1FW)=/342.3(蔗糖摩尔质量）X酶提取液的总体积（mL)/[样品鲜重（g)X反应时所加的 酶液体积（mL)X反应时间（h)。 根据以上公式计算出相应的酶活性，如表3所示。表 3 本实施例的提取缓冲液没有巯基乙醇等有毒或腐蚀性药品，为保障科研人员身体 健康提供了条件。 本实施例采用离心式去盐柱可有效将初提取酶液中的盐分、糖分、离子等小分子 物质除去，从而更能够精确地测定叶片中蔗糖磷酸合成酶的活性，且离心式去盐柱具有可 再生性，可大大降低科研成本。 本实施例优化了甜瓜叶片蔗糖磷酸合成酶与底物反应条件，可真实反应酶活性水 平，并缩短了酶活性测定的时间，提高了科研效率。 以上所述的本专利技术实施方式，并不构成对本专利技术保护范围的限定。任何在本专利技术 的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本专利技术的权利要求保护范 围之内。【主权项】1. ，包括以下步骤： (1) 酶液提取：称取2g甜瓜新鲜叶片，放入预冷的研钵中，加IOmL提取缓冲液；冰浴下 研磨，充分勾衆后，0~4°C条件下12000rpm离心20min，取上清液，去除初提酶液中的盐分， 纯化后的酶液可直接用于酶活性测定； (2) 酶活性测定：以0. 2mL酶液沸水浴IOmin为对照；取0. 2mL酶液加入反应底 物，15~40 °C条件下反应3~30min ;沸水浴lmin，用双蒸水定容至ImL ;加入0.1 mL 2mol ? L 1NaOH,沸水浴lOmin，流水冲洗冷却；向反应液中加入3. 5mL 30% HC1，ImL 0. 1% 间苯二酸，摇勾后在80°C水浴锅中水浴lOmin，流水冷却后，480nm比色。2. 根据权利要求1所述的，其特征 在于：步骤（1)中，所述提取缓冲液由以下组分组成 ：50mm本文档来自技高网...
【技术保护点】
甜瓜叶片蔗糖磷酸合成酶的提取及活性测定方法，包括以下步骤：(1)酶液提取：称取2g甜瓜新鲜叶片，放入预冷的研钵中，加10mL提取缓冲液；冰浴下研磨，充分匀浆后，0～4℃条件下12000rpm离心20min，取上清液，去除初提酶液中的盐分，纯化后的酶液可直接用于酶活性测定；(2)酶活性测定：以0.2mL酶液沸水浴10min为对照；取0.2mL酶液加入反应底物，15～40℃条件下反应3～30min；沸水浴1min，用双蒸水定容至1mL；加入0.1mL 2mol·L‑1NaOH，沸水浴10min，流水冲洗冷却；向反应液中加入3.5mL 30％HCl，1mL 0.1％间苯二酚，摇匀后在80℃水浴锅中水浴10min，流水冷却后，480nm比色。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：田红梅，方凌，严从生，王朋成，王艳，张其安，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院园艺研究所，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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