藜麦EST-SSR分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术涉及分子标记技术领域，具体涉及藜麦EST‑SSR分子标记及其开发方法与应用。一组藜麦EST‑SSR分子标记包括66个位点所对应的正向和反向引物，其开发方法包括步骤：1)从NCBI数据库获得RNA‑seq及EST序列；2)利用生物信息学软件对序列进行处理、组装、拼接成unigene，并对unigene进行SSR位点搜索获取EST‑SSR；3)设计EST‑SSR引物扩增藜麦基因组DNA对EST‑SSR进行验证，利用验证的EST‑SSR分子标记在藜科种质中进行遗传多样性分析的应用。本发明专利技术基于公共数据库开发的EST‑SSR分子标记具有高效性,成功率高、多态性丰富,且通用性较强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子标记
，具体涉及藜麦EST-SSR分子标记及其开发方法与 应用。
技术介绍
SSR(simplesequencerepeat)又称为微卫星DNA，由2个~6个喊基的单元序 列串联重复而成，具有多态性高、共显性、数量丰富等特点，广泛用于遗传图谱构建、遗传多 样性分析等。早期发展SSR标记的方法通常采用构建文库的方式进行，包括基因组文库和 cDNA文库。通常基于EST(expressedsequencetag)发展的SSR称为EST-SSR，与通过基 因组序列发展的基因组SSR相比，EST-SSR因其两端侧翼序列的保守性较强，在不同物种间 具有良好的通用性。近年来，利用公共数据库中丰富的基因组序列以及表达序列信息发展 分子标记成为分子标记开发的重要途径。 藜麦（ChenopodiumquinoaWilld.)，原产于南美安第斯地区，是一种一年生藜科 双子叶草本产种植物，具有出色的耐干旱、耐盐碱的特性，是唯一一种被联合国粮农组织认 可的单体即可满足人体基本营养需求的植物。据报道，藜麦基因组大小约为967M，为异源四 倍体物种（2n= 4x= 36)，基因组序列组装困难，至今尚无基因组测序相关报道，因此，很 难大规模开发分子标记。RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)是首先报道的基于 藜麦DNA的分子标记。此类分子标记可用于藜麦种间杂交种的鉴定以及藜麦和其它藜科物 种的遗传变异分析。随后，通过对富含微卫星基元的克隆进行测序，Masonetal.开发并 验证了 208个在藜麦种间具有较高多态性的共显性SSR分子标记。研究表明，相比于二核 苷酸重复的SSR分子标记，三核苷酸重复的SSR(>20bp)具有更高的多态性。借助富含 GA，CAA和AAT重复的文库以及BES(bacterialartificialchromosome-endsequence)， Jarvisetal.开发了 216 个新型多态性SSR以及 6 个BES-SSR，多态性PIC(polymorphism informationcontent)介于0. 12~0. 90之间，并构建了藜麦首个基于SSR标记的遗传连 锁图谱。该遗传连锁图谱包含200个SSR，由38个连锁群组成，覆盖了藜麦913cM的遗传距 离。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前藜麦分子标记数量较少的不足，利用公共数据库中藜麦 表达序列数据，通过生物信息学手段大规模挖掘藜麦EST-SSR，对部分藜麦EST-SSR进行了 验证及多态性分析，并利用开发的EST-SSR对藜科种质的遗传多样性进行了评价。 为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一组藜麦EST-SSR分子标记，其特 征在于：包括有如下66个位点所对应的正向和反向引物： 本专利技术所述的藜麦EST-SSR分子标记的开发方法，包括以下步骤： 1)从NCBI数据库获取RNA-seq及EST序列； 2)利用生物信息学软件对序列进行处理、组装、拼接成unigene，并对unigene进 行SSR位点搜索从而获取EST-SSR; 3)设计EST-SSR引物扩增藜麦基因组DNA，并对EST-SSR进行验证； 进一步的，在所述步骤3)中，EST-SSR引物设计采用如下参数设置：Tm为 58°C±3°C，引物长度为20bp±3bp，产物预期长度为IOObp~450bp。 进一步的，所述步骤3)中PCR扩增程序为94°C3min;94°C30s，58°C35s， 72°C50s，38 个循环；72°C3min。 进一步的，所述步骤3)中PCR扩增体系为25y1，含有2mmol/LMgCl2,100ymol/ LdNTP，0. 2ymol/L引物，IUTaq酶及 50ngDNA。 本专利技术所述的藜麦EST-SSR分子标记在藜科种质遗传多样性分析中的应用。 进一步的，所述藜科种质是指包括藜麦在内的藜科植物。 本专利技术的有益效果： 1、本专利技术基于公共数据库开发的EST-SSR分子标记具有高效性。本专利技术根据获取 的14.OG藜麦RNA-Seq数据以及EST数据拼接得到19, 571条unigene。其中，16, 854条 序列含有20, 338SSR位点，包含1，862个非单核苷酸重复SSR(二、三、四、五、六核苷酸重 复）。 2、本专利技术开发的EST-SSR成功率高、多态性丰富。随机选取119对EST-SSR引物 对藜麦DNA以及其它藜科种质DNA中进行扩增。结果显示，共有66对能够在藜麦DNA扩增 中获得清晰的扩增条带，成功率55. 9%。66对引物中，58对引物在10%的聚丙烯酰胺凝胶 上能够扩增出两种以上类型的条带，其中5对引物能够扩增出最多的4种类型条带，平均每 对引物能扩增出2. 2种条带。通过PIC计算，61个为多态性EST-SSR(PIC彡0. 10)，占总数 的 92. 4% 〇 3、本专利技术开发的EST-SSR通用性较强。本专利技术收集了 8份来源不同的藜科种质，包 括4份藜麦，2份苍白茎藜，1份台湾藜和1份杖藜，分别来自于四个大洲的5个国家地区。 66对EST-SSR引物在8份藜科种质DNA中均能扩增出多种类型的条带，显示了良好的通用 性。【附图说明】 图1为基于相似性系数构建的8份藜科种质的UPGMA树状图。【具体实施方式】 以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 1)藜麦表达序列数据的获取及unigene的拼接。从NCBI的SRA数据库（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)共获取 11. 9GIlluminaHiSeq2000 的RNA-Seq数据（登录 号：SRX257003 和SRX256971)以及 2.IGRoche454 的EST数据（登录号：SRX084791)。经 过对原始数据进行转换、清理、过滤，利用Trinity软件拼接得到19, 571条unigene，总碱基 数为80, 448, 006bp，平均每条unigene长约4kb。其中16, 854条序列含有SSR位点。 2)藜麦EST-SSR位点的鉴定。通过MISA软件（http://pgrc.ipk-gatersleben. de/misa/)对unigene序列进行SSR位点识别，SSR位点的识别条件为：单核苷酸重复不低 于10次，二核苷酸重复不低于8次，三核苷酸重复不低于7次，四核苷酸重复不低于5次， 五核苷酸及六核苷酸重复不低于4次；复合SSR的识别条件是2个SSR之间的距离不超过 50bp。结果发现藜麦EST-SSR重复类型丰富，从单核苷酸重复到六核苷酸重复均有出现。 非单核苷酸重复有1，862个。其中，二核苷酸重复SSR最多，占非单核苷酸重复SSR总数的 38. 3% (713个），其次为三核苷酸重复，占非单核苷酸重复SSR总数的22. 7% (423个），最 少的为六核苷酸重复，占非单核苷酸重复SSR总数的11. 7% (217个）。 3)藜麦EST-SSR的引物设计。利用Primer3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组藜麦EST‑SSR分子标记，其特征在于：包括有如下66个位点所对应的正向和反向引物：

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张体付，赵涵，戚维聪，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32